Đồ án Nuôi cấy mô

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này Trước hết tôi xin gởi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Giấm Đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc tới thầy: Th.s Lê Phương Chung – Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và Th.s Nguyễn Trọng Lực – Trưởng phòng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật – Trung Tâm Ứng Dụng Và Chuyển Giao Công Nghệ - Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang và các anh chị trong Trung Tâm Ứng Dụng và Chuyển Giao Công Nghệ – Sở Khoa Học Và Công Nghệ tỉnh Phú yên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiên, động viên, khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua Nha trang, ngày tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Huỳnh Uyên i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT .................................................................. vi LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................ 3 1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................ 3 1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) ................................ 3 1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào ................................................................... 3 1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào ................................. 4 1.1.2.3. Sự trẻ hoá ............................................................................................ 4 1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV ...................................... 5 1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV ............................... 6 1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV .................................................... 6 1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng................................................................... 7 1.1.5.2. Nuôi cấy mô sẹo. ................................................................................. 7 1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn. .......................................................... 8 1.1.5.4. Nuôi cấy protoplast ............................................................................. 9 1.1.5.5. Nuôi cấy mô cơ quan tách rời ............................................................. 9 1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn .......................................................................... 10 1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV .............................................................. 10 1.1.6.1. Khoáng đa lượng .............................................................................. 11 1.1.6.2. Khoáng vi lượng ................................................................................ 12 1.1.6.3. Nguồn cacbon ................................................................................. 12 1.1.6.4. Các vitamin ....................................................................................... 13 1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác ........................... 13 ii 1.1.6.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ............................................ 14 1.1.7. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................ 18 1.1.7.1. Giai đoạn chuẩn bị ........................................................................... 18 1.1.7.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy ...................................................... 18 1.1.7.3. Giai đoạn nhân nhanh....................................................................... 19 1.1.7.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh ........................................................... 19 1.1.7.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm ...................................... 20 1.1.8. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV ............ 20 1.1.8.1. Điều kiện vô trùng ............................................................................. 20 1.1.8.2. Ánh sáng và nhiệt độ ......................................................................... 22 1.1.8.3. pH môi trường ................................................................................... 23 1.2. Giới thiệu về cây lan gấm .............................................................................. 23 1.2.1. Phân loại thực vật .................................................................................... 23 1.2.2. Đăc điểm thực vật ................................................................................... 24 1.2.3. Sự phân bố .............................................................................................. 26 1.2.4. Tính dược liệu và công dụng.................................................................. 26 1.2.5. Tình hình nghiên cứu cây lan gấm........................................................ 27 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 28 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 28 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy .................................................................................. 28 2.2. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................... 29 2.3. Địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu. ......................................... 30 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu. ........................................................................... 30 2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm. ............................................................. 30 2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm ................ 30 2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi. ........................... 32 2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi .................................................................................... 33 iii 2.4.1.4. Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi ...................................................................... 33 2.4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân nhanh ................................. 35 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu. ........................................................................... 36 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 37 3.1. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm ........................................... 37 3.1.1. Khử trùng bằng Javen ............................................................................ 37 3.1.2. Khử trùng bằng chlorine ........................................................................ 39 3.1.3. Khử trùng kết hợp Javen và Chlorin ..................................................... 40 3.2. Tái sinh chồi .................................................................................................. 42 3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng khoáng thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm ........................................................................................................ 45 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi ............................................................................................ 46 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi. ........................................................................................................................... 47 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. ................................................................................................................... 49 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi .......... 50 3.5. Khảo sát quá trình nhân nhanh .................................................................. 53 3.6. Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm ..................................................... 55 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 57 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 57 4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 58 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Công thức khử trùng mẫu ......................................................................... 31 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi của vật liệu nuôi cấy ........................................................................................................ 33 Bảng 2.3. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi. ................................ 34 Bảng 2.4. Ảnh hưởng của các nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. ..... 34 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi. ......... 35 Bảng 2.6: Khảo sát quá trình nhân nhanh ................................................................ 36 Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen ...................................... 37 Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine ................................. 39 Bảng 3.3. Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine. ............................ 40 Bảng 3.4. So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. ............... 41 Bảng 3.5. Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy ............................................................... 42 Bảng 3.6. Ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp nhân nhanh lan gấm. ............. 45 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi ................... 47 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi .......................... 49 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy51 Bảng 3.10. Khảo sát quá trình nhân nhanh ............................................................... 53 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume ............................................ 25 Hình 3.1. Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. .............. 41 Hình 3.2. Mẫu sau khi khử trùng .............................................................................. 42 Hình 3.3. Sự tái sinh chồi ......................................................................................... 44 Hình 3.4. Sự phát triển hình thái chồi trên các môi trường khoáng ........................ 46 Hình 3.5. Sự phát triển hình thái chồi với các nồng độ BA khác nhau .................... 48 Hình 3.6. Sự phát triển của chồi với các nồng độ Kinetin khác nhau ..................... 50 Hình 3.7. Sự phát triển của chồi với các nồng độ TDZ khác nhau .......................... 52 Hình 3.8. Khảo sát quá trình nhân nhanh ................................................................ 54 Hình 3.9. Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm .............................................. 55 Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh lan gấm ............................................................... 56 vi KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT TBTV : Tế bào thực vật DNA : Deoxyribonucleotic acid RNA : Ribonucleotic acid MS :Murashige&Skoog VW :Vaccine và Went KC :Kundson C LS : Linsmainer và Skoog ATP : Adenosine triphosphate GA3 : Acid ascorbic ĐTD : Đơn tử diệp STD : Sông tử diệp 1 LỜI MỞ ĐẦU Thế kỉ 21 được coi là thế kỷ của sự phát triển công nghệ sinh học trong đó dược liệu là tài nguyên di truyền - tài nguyên tái tạo. Nắm được, phát huy được tài nguyên di truyền là nắm kinh tế, nắm tương lai. Dùng thế mạnh dược liệu đẩy - - tộc.Từ lâu, người phương đông đã tôn hoa Lan là “ vương giả chi hoa” và người phương tây cũng tôn hoa Lan là “ nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa Lan đã chinh phục người phương Đông và người phươngTây không chỉ cấu trúc kì diệu và sự đa dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ mà còn bỡi giá trị làm thuốc của nó. Từ xưa, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ. , Hơn nữa, hạt lan lại quá nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên là rất thấp. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay người ta tiến hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, cây con được tạo ra với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không ngừng tăng lên của thị trường.. Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được. Nói đến chi lan gấm Anoectochilus, thì loài lan gấm Anoectochilus setaceus Blume được biết đến nhiều hơn cả không chỉ bởi giá trị làm cảnh do lá và hoa đẹp mà còn vì giá trị làm thuốc của nó. Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng 2 huyết áp, đau nhức khớp xươngHơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này. Như vậy, lan Gấm Anoectochilus setaceus. Blume là loại thảo dược có giá trị và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam số lượng loài này trong tự nhiên được phát hiện còn rất ít mà lại bị thu hái cả cây với số lượng lớn để bán làm thuốc (500,000VNĐ/ kg tươi) do vậy loài lan này đang bị đe doạ mạnh và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Gấm được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP; và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007. Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ sinh học- Viện công nghệ sinh học và môi trường - trường Đại học Nha Trang, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) ” tìm ra điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. 3 Chƣơng I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng [3] Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra. Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật. Phương pháp này giúp mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước: - Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra khỏi phần còn lại. Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn nhau trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn. - Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biểu lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.[3] 1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi . Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào 4 bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.[7] 1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó. Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa. Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra quá trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào. Người ta đã tổng kết rằng; những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa. Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc. 1.1.2.3. Sự trẻ hoá Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần cơ quan thực vật là rất khác nhau. Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu. Trong nuôi cấy mô TBTV( hay còn gọi là nuôi cấy in vitro), các mẫu non trẻ có sự 5 phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn.[7] 1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV Quá trình nuôi cấy mô TBTV có những ưu điểm như sau: - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây sau khi được nuôi cấy từ 1 đến 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây. - Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng