Đồ án Phân lập, tuyển chọn và đánh giá một số đặc tính của một số chủng lactobacillus trên cá chim vây vàng (Đại học Nha Trang)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN Lớp : 49 CNSH Khoá : 49 Nha Trang, tháng 7 năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN Lớp : 49 CNSH Khoá : 49 Nha Trang, tháng 7 năm 2011 GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Lê Đình Đức, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp 49SH, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 6 năm 2011 Sinh viên Lê Thanh Huân GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ........................................................................ vii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... viii LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1.1.1. Giới thiệu vê Probiotics ............................................................................................ 3 1.1.2. Cơ chế tác động của probiotic ................................................................................. 5 1.1.2.1. Sản sinh ra các chất ức chế ............................................................................... 5 1.1.2.2. Cạnh tranh cơ chất, năng lượng với những vi khuẩn khác ............................... 5 1.1.2.3. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh ............................................ 6 1.1.2.4. Tăng cường đáp ứng miễn dịch ......................................................................... 6 1.1.2.5. Cải thiện chất lượng nước ................................................................................. 7 1.1.3. Ứng dụng của probiotic ............................................................................................ 7 1.1.3.1. Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong y học, trong trồng trọt, trong bảo vệ môi trường. ............................................................................................................... 7 1.1.3.2. Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong nuôi trồng thủy sản .................... 8 1.1.4. Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics. ............................................................ 11 1.1.4.1. Nguyên liệu ...................................................................................................... 12 1.1.4.2. Nhân giống ....................................................................................................... 12 1.1.4.3. Thu sinh khối .................................................................................................... 12 1.1.4.4. Tạo chế phẩm ................................................................................................... 12 1.1 .................................................................................... . Tổng quan về cá chim vây vàng 14 1.2.1. Giới thiệu chung về cá chim vây vàng ................................................................... 14 1.2.2. Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới và trong nước ................ 15 1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới ................................ 15 1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng ở Việt Nam ................................. 16 GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân iii 1.2.3. Tình hình bệnh dịch trên cá nuôi nước mặn nói chung và cá chim vây vàng nói riêng 17 1.2.3.1. Bệnh do nấm, ký sinh trùng ......................................................................... 17 1.2.3.2. Bệnh do virus ................................................................................................. 18 1.2.3.3. Bệnh do vi khuẩn .......................................................................................... 18 1.2 ......................................................................................... . Tổng quan về vi khuẩn lactic 20 1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lactic ................................................................................ 20 1.3.1.1. Giới thiệu chung ............................................................................................. 20 1.3.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic .............................................................................. 22 1.3.1.2.1. Lên men đồng hình ..................................................................... 22 1.3.1.2.1. Lên men dị hình .......................................................................... 23 1.3.2. Giới thiệu về giống Lactobacillus ........................................................................... 23 1.3.2.1 Giống Lactobacillus – các đặc tính của vi khuẩn probiotic ........................ 24 1.3.2.2.1 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh .............................................................................................. 24 1.3.2.2.3 Khả năng chịu mặn ......................................................................... 25 1.3.2.2.4 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa ........................................... 25 1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của vi khuẩn lactic nói chung và Lactobacillus nói riêng. .............................................................................................. 26 1.3.2.1.1. Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng ............................................. 26 13.2.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ........................................... 29 1.3.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản ................................................................................................... 30 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 33 2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 33 2.1.1. Mẫu cá ....................................................................................................................... 33 2.1.2. Môi trường nghiên cứu ........................................................................................... 33 2. 2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 35 Hình 2.1:Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài ......................... 35 GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân iv 2. 3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 36 2.3.1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn ...................................................................... 36 2.3.1.1. Phân lập Lactobacillus ................................................................................... 36 2.3.1.2. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Lactobacillus ........................................... 36 2.3.1.3. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio .................................... 37 2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa ............................................... 38 2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái ......................................................................... 38 2.3.2.1.1. Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi ............................. 38 2.3.2.1.2. Nhuộm Gram ............................................................................... 38 2.3.2.2. Quan sát đặc tính sinh hóa ............................................................................ 39 2.3.2.2.1. Khả năng sinh acid lactic ............................................................ 39 2.3.2.2.2. Phản ứng catalase ........................................................................ 40 2.3.2.2.3. Khả năng di động ........................................................................ 40 2.3.2.2.4. Khả năng sử dụng các loại đường: ............................................ 41 2.3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy ............................................................................ 41 2.3.3.1. Xác định khả năng sinh trưởng .................................................................... 41 2.3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp .......................................................................... 42 2.3.3.3. Xác định thời gian nuôi cấy .......................................................................... 42 2.3.3.4. Xác định pH thích hợp .................................................................................. 42 2.3.4. Xác định các đặc tính probiotic ............................................................................. 42 2.3.4.1. Xác định khả năng sinh enzyme tiêu hóa .................................................... 42 2.3.4.2. Xác định khả năng chịu mặn ........................................................................ 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 44 3.1. Kết quả phân lập tuyển chọn .............................................................................. 44 3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá chim vây vàng .......................................... 44 3.1.2. Kết quả tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio ........... 44 3.2. Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa .......................................................... 46 3.2.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................................. 46 3.2.1.1. Đặc điểm hình thái của chủng L1.2 .............................................................. 46 GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân v 3.2.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng L1.3 .............................................................. 48 3.2.2. Đặc điểm sinh hóa ................................................................................................... 51 3.3. Đặc tính nuôi cấy và đặc tính probiotic ............................................................. 52 3.3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3 ................................................ 52 3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3 ................ 54 3.3.3. Thời gian nuôi cấy ................................................................................................... 55 3.3.4. pH nuôi cấy .............................................................................................................. 56 3.3.5. Khả năng chịu mặn của hai chủng L1.2 và L1.3 .................................................. 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 59 Kết luận .............................................................................................................................. 59 Kiến nghị ............................................................................................................................ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 60 GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio của 5 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, ở nhiệt độ 37oC ....................................................................................... 45 Bảng 3.2: Kết quả thử các đặc tính của hai chủng L1.2 và L1.3 .................................. 52 GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân vii DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 : Cá chim vây vàng ......................................................................................... 14 Hình 3.1: Khả năng đối kháng 7 chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1, C7 và C23) của 6 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37oC ......................... 45 Hình 3.2: Vòng kháng Vibrio của 2 chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC ............................ 46 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C .................................................................................................................... 47 Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng L1.2 khi soi tươi ở vật kính 100X ..................... 47 Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm gram của chủng L1.2 ......................................................... 48 Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.3 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C .................................................................................................................... 49 Hình 3.7: Hình thái tế bào của chủng L1.3 khi soi tươi ở vật kính 100X ..................... 49 Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3 ............................................................... 50 Hình 3.9: Khả năng di động của chủng L1.2 và L1.3 ................................................... 51 Hình 3.10: Khả năng lên men các loại đường của chủng L1.2 và L1.3 ........................ 51 Hình 3.11: Mối tương quan giữa thời gian và OD600 nm của chủng L1.2 ..................... 53 Hình 3.12: Mối tương quan giữa thời gian và OD600 của chủng L1.3 ......................... 53 Hình 3.13 : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 ....................................................................................................... 55 Hình 3.14: Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào sống của hai chủng L1.2 và L1.3 ở OD600 nm. ............................................................................ 56 Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 ........................................................................................................................... 57 Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng L1.2 và L1.3 ........................................................................................................................... 58 GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân viii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân 1 LỜI MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, nghành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang phát triển nhanh chóng. Theo công bố của FAO năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản của Việt Nam là 1,67 triệu tấn, xếp vị trí thứ 6 Châu Á. Hiện nay đối tượng nuôi trồng chủ yếu là các loài thủy hải sản nước mặn như: cá mú (Epinephelus spp), cá giò (Rachycentron canadum), cá chẽm (Lates calcariper), cá cam (Seriola spp), cá hồng (Lutijanus erythropterus), cá chim (Trachinotus blochii), ốc hương (Babylonia areolata), vẹm xanh (Perna viridis), tôm sú (Penaeus monodon),... trong đó đối tượng nuôi mới là cá chim vây vàng đang được chú ý phát triển nuôi bởi vì thịt cá thơm ngon hấp dẫn, hàm lượng dinh dưỡng cao, rất được ưa chuộng. Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) là loài phân bố tương đối rộng ở vùng biển nhiệt đới, Tây Thái Bình Dương, Nhật Bản, Đài Loan, Indonesia, miền Nam Trung Quốc. Nước ta cá phân bố chủ yếu ở vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ. Cá có kích cỡ thương mại 0,8 -1 kg/con, giá trị kinh tế cao với giá bán 100.000 VNĐ/kg, thị trường xuất khẩu: Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc, Hồng Kông, Mỹ, Singapore. Đây là một đối tượng nuôi mới ở Việt Nam, chưa được nghiên cứu nhiều nên người nuôi vẫn gặp khó khăn do tỷ lệ cá chết cao, sức chống chọi trước các điều kiện bất lợi của môi trường và các vi khuẩn gây bệnh còn thấp đặc biệt là các bệnh do Vibrio gây ra. Để khắc phục tình trạng này, người nuôi đã dùng các loại hóa chất khử trùng, các chất kháng sinh phòng bệnh. Tuy nhiên hiệu quả của các phương pháp này không cao, ngược lại còn gây ảnh hưởng đến môi trường, nguy hiểm hơn nếu lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây ra tồn dư kháng sinh và hiện tượng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản. Vì vậy, việc tìm ra một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính: đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, sinh các enzyme tiêu hóa, phân hủy các chất hữu cơ thừa …đã được áp dụng. Các chế phẩm sinh học không những tăng GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân 2 khả năng sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho vật nuôi mà còn hạn chế được tối đa khả năng sử dụng kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh thủy sản. Nhiều nhóm vi sinh vật mang các đặc tính probioic đã được áp dụng, trong đó có nhóm vi khuẩn Lactobacillus. Với lí do như vậy nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và đánh giá tiềm năng probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập trên Cá Chim vây vàng” Mục tiêu của đề tài là phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio để bổ sung vào chế phẩm probiotic nuôi cá chim vây vàng nhằm mục đích tăng tốc độ tăng trưởng, khả năng kháng bệnh, đảm bảo sự phát triển bền vững của nghề nuôi cá chim vây vàng. Các nội dung nghiên cứu của đề tài: - Phân lập các chủng Lactobacillus và Vibrio trong ruột cá chim vây vàng. - Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính khảng Vibrio. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng Lactobacillus. - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hơp cho các chủng Lactobacillus. GVHD: Th.s Lê Đình Đức SVTH: Lê Thanh Huân 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về probiotic 1.1.1. Giới thiệu vê Probiotics Theo Tổ chức nông nghiệp và lương thực của Liên hợp quốc (FAO) “Probiotic là những vi sinh vật sống, nếu được bổ sung với liều lượng hợp lý sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ”. Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhưng tác dụng của nó đã được nhận thấy từ lâu. Elie Metnhicoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908). Năm 1908, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic