Khảo sát hoạt tính và tinh sạch protease từ hai chủng nấm mốc aspergillus oryzae và aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ĐẬU THỊ KIM DUNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sƣ Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện : TS. NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẬU THỊ KIM DUNG PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Khóa : 2002 - 2006 CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON SEMI SOLID MEDIUM Graduation thesis Major : Biotechnology Professors : Student : PhD. NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG Vice Professor-PhD. NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006 BA. ĐO THI TUYEN HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến : * Ban Giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. * Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn tất khóa luận này. * Anh Nguyễn Diên Sanh, anh Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ trợ cũng nhƣ cung cấp cho em nhiều kiến thức xung quanh đề tài. * Các bạn lớp CNSH K28 đã động viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng nhƣ chia xẻ những vui buồn trong suốt thời gian học tập. * Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. * Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin và động lực bƣớc vào đời. TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC v ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG BÁN RẮN”. Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM. Hội đồng hƣớng dẫn : PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TS. NGUYỄN NGOC HẢI CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki đƣợc chiết bằng nƣớc cất, thu đƣợc dịch chiết enzyme thô. Dịch chiết thô này đƣợc tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60, 65, 70, 75 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Cặn tủa thu đƣợc hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu đƣợc từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel và xác định trọng lƣợng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau :  Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ƣu để tủa protease.  Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470C.  Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus kawasaki. MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa ..................................................................................................................................... i Trang tựa .......................................................................................................................... ii vi Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ........................................................................................................... iv Mục lục ............................................................................................................................ v Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix Danh sách các hình và đồ thị .......................................................................................... xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2 Mục đích nghiên cứu ................................................................................................. 2 1.3 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2 2.1 Khái quát chung về enzyme ...................................................................................... 3 2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme ........................................................... 3 2.1.2 Định nghĩa về enzyme ............................................................................................ 5 2.1.3 Phân loại enzyme .................................................................................................... 6 2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ........................ 7 2.1.4.1 Hoạt tính enzyme ................................................................................................. 7 2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme ......................................... 7 2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống .......................................... 9 2.1.5.1 Nguồn thu nhận ................................................................................................... 9 2.1.5.2 Vai trò ................................................................................................................ 11 2.2 Khái quát chung về enzyme protease ...................................................................... 11 2.2.1 Định nghĩa enzyme protease ................................................................................ 11 2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease .............................................................. 12 2.2.2.1 Protease từ động vật .......................................................................................... 12 2.2.2.2 Protease từ thực vật ........................................................................................... 12 2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật ........................................................................................ 13 2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease......................................................................... 13 2.2.3.1 Từ động vật ........................................................................................................ 13 2.2.3.2 Từ thực vật ......................................................................................................... 13 2.2.3.3 Từ vi sinh vật ..................................................................................................... 14 2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 14 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ...................................... 15 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................... 15 2.3.1.1 Phân loại ........................................................................................................... 15 2.3.1.2 Đặc điểm ............................................................................................................ 15 2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt ................................ 16 2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease ................................. 18 2.5.1 Trích ly enzyme .................................................................................................... 19 2.5.2 Quá trình tủa ........................................................................................................ 20 2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký ....................................................... 22 2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE ............................................................................................................................. 27 PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 29 3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 29 3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 29 3.2.1 Chế phẩm enzyme thô .......................................................................................... 29 3.2.2 Hóa chất ................................................................................................................ 29 vii 3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 29 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .......................................................................................... 30 3.3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 30 3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme thô .................................................................................................................................. 30 3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme protease ............................................................................................................ 36 3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của protease .... 37 3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel...................................... 37 3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme bằng phƣơng pháp điện di SDS – PAGE ............................................................................................................. 41 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 44 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................... 45 4.1 Hàm lƣợng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô ................................................ 45 4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ƣu cho việc tủa protease .......................................... 45 4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 46 4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 48 4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease ..................................................................... 49 4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ........................................................................ 49 4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................... 51 4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4 .................... 53 4.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease...................... 54 4.5.1 pH tối ƣu ............................................................................................................... 54 4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae ........................................................ 54 4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki .................................................... 54 4.5.2 Nhiệt độ tối ƣu ...................................................................................................... 55 4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae ..................................................................... 55 4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki ................................................................ 56 4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel ................................................................................... 56 4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae ................................................................................... 57 4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki .............................................................................. 59 4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki ................................................................. 62 4.7.1 Tủa protease bằng muối ........................................................................................ 62 4.7.2 Tủa protease bằng cồn .......................................................................................... 62 4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS – PAGE ............................................................................................................................. 63 PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 67 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 67 5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ..................................................................... 67 5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki ................................................................ 67 5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki .......................... 68 5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 69 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 70 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ Asp.oryzae : Aspergillus oryzae Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp). ix CBB : Coomasie Brilliant Blue. ĐVHT : Đơn vị hoạt tính. HT : Hoạt tính HTR : Hoạt tính riêng. TCA : Trichloacetic acid A.U : Độ hấp thụ. mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lƣờng độ dẫn điện). UI : Đơn vị hoạt tính enzyme. DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein .......................................... 22 Bảng 3.1 Đƣờng chuẩn Albumin ................................................................................... 32 x Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn Tyrosine ................................................................................... 34 Bảng 3.3 Khối lƣợng (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ ...................................... 36 Bảng 3.4 Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ. ............................................................ 36 Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki ................................................................. 45 Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ................................................ 46 Bảng 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối ............................................................ 46 Bảng 4.4 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối .................................................. 48 Bảng 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối ....................................................... 48 Bảng 4.6 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .................................................. 50 Bảng 4.7 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn .............................................................. 50 Bảng 4.8 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn .................................................... 51 Bảng 4.9 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn .......................................................... 52 Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. ................................................................ 53 Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH ................ 54 Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH ............ 55 Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ ......... 55 Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ .... 56 Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel ....... 59 Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel .... 61 Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng muối ...................................................................................................................... 62 xi Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng cồn ......................................................................................................................... 62 Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang. ............. 65 Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae .......... 66 Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki ..... 66 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ HÌNH TRANG Hình 2.1 Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ xii phản ứng ......................................................................................................................... 8 Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất ......................................................................................................................... 8 Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease ............................................................... 11 Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi ............................................... 16 Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae