Khảo sát về mặt thực vật học, hoạt tính ức chế enzym α - Amylase và α-glucosidase in vitro của cao chiết toàn phần từ mướp đắng rừng (momordica charantia l. var. abbreviata ser.), tầm bóp (physalis angulata l.), lô hội (aloe vera (l.) burm.f)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phùng Đan Thùy KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC, HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-AMYLASE VÀ α-GLUCOSIDASE IN VITRO CỦA CAO CHIẾT TOÀN PHẦN TỪ MƯỚP ĐẮNG RỪNG (MOMORDICA CHARANTIA L. VAR. ABBREVIATA SER.), TẦM BÓP (PHYSALIS ANGULATA L.), LÔ HỘI (ALOE VERA (L.) BURM.F) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phùng Đan Thùy KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC, HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-AMYLASE VÀ α-GLUCOSIDASE IN VITRO CỦA CAO CHIẾT TOÀN PHẦN TỪ MƯỚP ĐẮNG RỪNG (MOMORDICA CHARANTIA L. VAR. ABBREVIATA SER.), TẦM BÓP (PHYSALIS ANGULATA L.), LÔ HỘI (ALOE VERA (L.) BURM.F) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRƯƠNG THỊ ĐẸP TS. ĐỖ THỊ HỒNG TƯƠI Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 Học viên thực hiện luận văn Phùng Đan Thùy ii LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành đề tài luận văn một cách hoàn chỉnh bên cạnh sự cố gắng, nỗ lực của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy cô, cũng như sự động viên, quan tâm và giúp đỡ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS.Trương Thị Đẹp và TS. Đỗ Thị Hồng Tươi đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này. Xin được gửi lời tri ân sâu sắc của tôi đối với những điều mà các Cô đã dành cho tôi. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến quý Thầy cô của Trường, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học trường ĐH Sư Phạm Tp. HCM. Đặc biệt là quý Thầy cô quản lí phòng thí nghiệm bộ môn Thực Vật, bộ môn Dược lý, bộ môn Sinh hoá Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện, hỗ trợ các thiết bị và dụng cụ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Cuối cùng tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ và gia đình đã không ngừng động viên, hỗ trợ, chia sẻ mọi khó khăn trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 Học viên thực hiện luận văn Phùng Đan Thùy iii MỤC LỤC 5TLỜI CAM ĐOAN5T ...........................................................................................................i 5TLỜI CẢM ƠN5T ............................................................................................................... ii 5TMỤC LỤC5T .................................................................................................................... iii 5TDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT5T ........................................................................... v 5TDANH MỤC CÁC BẢNG5T ............................................................................................vi 5TDANH MỤC CÁC HÌNH5T .......................................................................................... vii 5TMỞ ĐẦU5T ......................................................................................................................... 1 5T1. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI5T ................................................................................................ 1 5T2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU5T ........................................................................................ 2 5T3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU5T ..................................................................................... 2 5T4. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU5T ....................................................................................... 2 5T . PHẠM VI NGHIÊN CỨU5T .......................................................................................... 3 5T6. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN5T ................................................................. 3 5TChương 1. TỔNG QUAN5T .............................................................................................. 4 5T1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG5T .................................................... 4 5T1.1.1. Khái niệm5T ...................................................................................................... 4 5T1.1.2. Yếu tố nguy cơ5T ............................................................................................... 4 5T1.1.3. Phân loại5T ....................................................................................................... 4 5T1.1.4. Dịch tễ5T ........................................................................................................... 5 5T1.1.5. Chẩn đoán5T ..................................................................................................... 6 5T1.1.6. Thuốc điều trị đái tháo đường5T ...................................................................... 6 5T1.2. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU5T ........................................................................... 11 5T1.2.1. Mướp đắng rừng5T ......................................................................................... 11 5T1.2.2. Tầm bóp5T ...................................................................................................... 14 5T1.2.3. Lô hội5T .......................................................................................................... 16 5T1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ LÀM KHÔ MẪU5T ...................... 20 5T1.3.1. Phương pháp ngâm5T ..................................................................................... 20 5T1.3.2. Phương pháp chiết các nguyên liệu tươi5T .................................................... 21 5T1.3.3. Các phương pháp làm khô mẫu5T .................................................................. 21 iv 5T1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CỦA CÂY MƯỚP ĐẮNG RỪNG, TẦM BÓP, LÔ HỘI5T ...................................................... 22 5T1.4.1. Nghiên cứu trên Mướp đắng rừng5T .............................................................. 22 5T1.4.2. Nghiên cứu trên Tầm bóp5T ........................................................................... 24 5T1.4.3. Nghiên cứu trên Lô hội5T ............................................................................... 25 5TChương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU5T ........................................................... 26 5T2.1. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU5T ................................... 26 5T2.1.1. Thời gian nghiên cứu5T .................................................................................. 26 5T2.1.2. Địa điểm nghiên cứu5T ................................................................................... 26 5T2.1.3. Vật liệu nghiên cứu5T ..................................................................................... 26 5T2.1.4. Dung môi, hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu5T ............................ 26 5T2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU5T .......................................................................... 28 5T2.2.1. Khảo sát về mặt thực vật học5T ...................................................................... 28 5T2.2.2. Chiết xuất và thu cao dược liệu5T .................................................................. 28 5T2.2.3. Khảo sát tác dụng hạ đường huyết in vitro của các cao dược liệu5T ............ 29 5T2.2.4. Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê5T ................................................ 31 5TChương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN5T ..................................................................... 32 5T3.1. KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC5T ............................................................. 32 5T3.1.1. Cây Mướp đắng rừng5T .................................................................................. 32 5T3.1.2. Cây Tầm bóp5T ............................................................................................... 40 5T3.1.3. Cây Lô hội5T ................................................................................................... 47 5T3.2. HIỆU SUẤT CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU5T .............................................................. 53 5T3.3. HOẠT TÍNH ỨC CHẾ α-AMYLASE, α-GLUCOSIDASE CỦA DƯỢC LIỆU5T ..... 53 5T3.3.1. Hoạt tính ức chế α-amylase5T ........................................................................ 53 5T3.3.2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase5T .................................................................. 56 5TKẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ5T ..................................................................................... 60 5TKẾT LUẬN5T ................................................................................................................... 60 5TKIẾN NGHỊ 5T ................................................................................................................... 61 5T ÀI LIỆU THAM KHẢO5T ........................................................................................... 62 5TPHỤ LỤC5T ......................................................................................................................... v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú giải ĐTĐ Đái tháo đường IDF International Diabetes Federation (Hiệp hội Đái tháo đường thế giới) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) ICR50 Inhibitive concentration (nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym) vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Đặc điểm của bệnh ĐTĐ týp 1 và týp 2 .......................................................... 5 Bảng 1.2. Một số dược liệu truyền thống sử dụng trong điều trị ĐTĐ ......................... 11 Bảng 1.3. Thành phần hóa học của Lô hội .................................................................... 17 Bảng 2.1. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài .................................................. 27 Bảng 3.1. Hiệu suất chiết của các cao từ Mướp đắng rừng, Tầm bóp, Lô hội .............. 53 Bảng 3.2. Hoạt tính ức chế α-amylase của thạch lá Lô hội ........................................... 55 Bảng 3.3. Hoạt tính ức chế α-amylase của mẫu thuốc đối chứng Acarbose và các cao từ Mướp đắng rừng và Tầm bóp .................................................................. 55 Bảng 3.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các cao dược liệu Mướp đắng rừng, Tầm bóp và gel lá Lô hội khảo sát ở nồng độ 1000, 2000, 3000 µg/ml .............. 56 Bảng 3.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của mẫu thuốc đối chứng acarbose, cao thân và lá Mướp đắng rừng, cao rễ Tầm bóp ....................................................... 57 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose ............... 9 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết cao toàn phần từ Mướp đắng rừng, Tầm bóp ............. 29 Hình 3.1. Đặc điểm hình thái Momordica charantia L. var. abbreviata Ser. .............. 36 Hình 3.2. Cấu tạo giải phẫu rễ Momordica charantia L. var. abbreviata Ser. ............ 37 Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu thân Momordica charantia L. var. abbreviata Ser. ........ 38 Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu lá Momordica charantia L. var. abbreviata Ser. ............ 39 Hình 3.5. Đặc điểm hình thái Physalis angulata L. ..................................................... 43 Hình 3.6. Cấu tạo giải phẫu rễ Physalis angulata L. .................................................... 44 Hình 3.7. Cấu tạo giải phẫu thân Physalis angulata L. ................................................ 45 Hình 3.8. Cấu tạo giải phẫu lá Physalis angulata L. .................................................... 46 Hình 3.9. Đặc điểm hình thái Aloe vera (L.) Burm. f ................................................... 49 Hình 3.10. Cấu tạo giải phẫu rễ Aloe vera (L.) Burm. f. .............................................. 50 Hình 3.11. Cấu tạo giải phẫu thân Aloe vera (L.) Burm. f ........................................... 51 Hình 3.12. Cấu tạo giải phẫu lá Aloe vera (L.) Burm. f ............................................... 52 Hình 3.13. Hoạt tính ức chế α-amylase của chất đối chứng Acarbose.......................... 53 Hình 3.14. Hoạt tính ức chế α-amylase của cao thử từ Mướp đắng rừng ..................... 54 Hình 3.15. Hoạt tính ức chế α-amylase của cao thử từ Tầm Bóp ................................. 54 Hình 3.16. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của chất đối chứng Acarbose .................... 57 Hình 3.17. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao thân và lá Mướp đắng rừng.......... 58 Hình 3.18. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao rễ Tầm Bóp .................................. 58 1 MỞ ĐẦU 1. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Đái tháo đường là tình trạng rối loạn chuyển hóa đa nguyên nhân, đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose huyết mạn tính và các rối loạn chuyển hóa carbohydrat, lipid, protein do thiếu insulin, đề kháng insulin hoặc cả hai. Tăng glucose huyết là hậu quả của bệnh đái tháo đường không kiểm soát được, dẫn đến tổn thương nghiêm trọng nhiều hệ thống trong cơ thể, đặc biệt mạch máu và thần kinh [53]. Hiện nay bệnh đái tháo đường được xem là căn bệnh nguy hiểm xếp thứ ba của nhân loại sau bệnh tim mạch và ung thư. Thực tế cho thấy số người mắc bệnh đái tháo đường trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng ngày càng gia tăng. Năm 2013, toàn thế giới có 382 triệu người mắc đái tháo đường và ước tính đến năm 2035 sẽ có 592 triệu người mắc bệnh. Trong đó có 5,1 triệu ca tử vong, trung bình cứ 6 giây lại có 1 người chết do mắc bệnh đái tháo đường [49]. Riêng Việt Nam, trong năm 2008 có khoảng 7% dân số ở nhóm tuổi 30-69 bị bệnh đái tháo đường và 17 000 người chết vì các biến chứng của căn bệnh này [52]. Ngày nay, có rất nhiều nhóm thuốc điều trị bệnh đái tháo đường như insulin, biguanid, sulfonylurea Tuy nhiên, việc điều trị bằng các nhóm thuốc này bên cạnh những tác dụng phụ như gây hạ đường huyết quá mức, rối loạn tiêu hóa, tác dụng phụ trên gan thận không phải lúc nào cũng kiểm soát đường huyết tốt và tránh được những biến chứng của bệnh đái tháo đường. Ngoài ra, gánh nặng kinh tế cho người bệnh cũng ngày càng tăng. Trong khi đó, hiệu quả điều trị đái tháo đường của các loại thảo dược dần dần được y học hiện đại nghiên cứu và chứng minh. Với thuận lợi khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng, nhiều cây thuốc, phương thuốc dân gian được cho là rất hữu hiệu trong việc kiểm soát glucose huyết như Tỏi, Cam thảo nam... Vì vậy nghiên cứu phát triển các thuốc hạ đường huyết có nguồn gốc từ dược liệu với ưu điểm rẻ tiền, an toàn khi sử dụng lâu dài trong điều trị các bệnh mạn tính là một trong những định hướng của ngành dược Việt Nam và trên thế giới. 2 Cây Mướp đắng rừng (Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.) thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), Tầm bóp (Physalis angulata L.) thuộc họ Cà (Solanaceae) và Lô hội (Aloe vera (L.) Burm.f) thuộc họ Lô hội (Aloaceae) là những món ăn, vị thuốc rẻ tiền khá phổ biến và đã được sử dụng trong dân gian để hạ đường huyết trên bệnh nhân đái tháo đường. Tuy nhiên cho đến nay Việt Nam có rất ít nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của các bộ phận từ ba dược liệu này. Từ những cơ sở đó, đề tài “Khảo sát về mặt thực vật học, hoạt tính ức chế enzym α-amylase và α- glucosidase in vitro của cao chiết toàn phần từ Mướp đắng rừng (Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.), Tầm bóp (Physalis angulata L.), Lô hội (Aloe vera (L.) Burm.f)” được tiến hành nhằm khảo sát về mặt thực vật học, sàng lọc bộ phận dùng tiềm năng từ ba dược liệu trên để ứng dụng trong nghiên cứu phát triển các thuốc hạ đường huyết, đóng góp thêm nhiều lựa chọn cho việc điều trị đái tháo đường an toàn. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Sàng lọc những dược liệu tiềm năng có hoạt tính hạ đường huyết. 3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Mướp đắng rừng, Tầm bóp được thu hái tại huyện Đồng Phú, tỉnh Bình Phước. Lá Lô hội tươi được thu hái tại vườn Dược liệu của Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. 4. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 1. Thu mẫu 3 loài dược liệu: Mướp đắng rừng (Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.), Tầm bóp (Physalis angulata L.), Lô hội (Aloe vera (L.) Burm.f), mô tả đặc điểm hình thái và đặc điểm giải phẫu. 2. Chiết cao toàn phần từ các bộ phận dùng của ba loại dược liệu trên, thử tác dụng hạ đường huyết in vitro qua các phản ứng khảo sát khả năng ức chế enzym α-amylase và ức chế enzym α-glucosidase. 3 5. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Khảo sát về mặt thực vật học bao gồm đặc điểm hình thái, đặc điểm giải phẫu và khảo sát tác dụng hạ đường huyết in vitro của các cao toàn phần từ 3 dược liệu Mướp đắng rừng, Tầm bóp, Lô hội. 6. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 1. Ý nghĩa khoa học: đóng góp chung vào công việc mô tả, phân biệt đặc điểm hình thái và giải phẫu của ba loài thực vật. 2. Ý nghĩa thực tiễn: sàng lọc những bộ phận dùng tiềm năng từ ba dược liệu Mướp đắng rừng, Tầm bóp, Lô hội, cung cấp cơ sở ban đầu cho những nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc hạ đường huyết. 4 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 1.1.1. Khái niệm Đái tháo đường (ĐTĐ) là rối loạn chuyển hóa đa nguyên nhân đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose huyết mạn tính và các rối loạn chuyển hóa carbohydrat, lipid, protein do thiếu insulin, đề kháng insulin hoặc cả hai. Hệ quả của tăng đường huyết mạn tính là tổn thương nhiều cơ quan như: mắt, thận, thần kinh [53]. 1.1.2. Yếu tố nguy cơ Béo phì, cao huyết áp, rối loạn chuyển hóa lipid, di truyền, nhiễm virus (quai bị, sởi) Thói quen ít vận động, ăn nhiều thức ăn giàu năng lượng, sử dụng nhiều chất kích thích như rượu, thuốc lá Phụ nữ mang thai, sinh con trên 4 kg hoặc bị sẩy thai hoặc bị đa ối. Sử dụng các thuốc: corticoid, thuốc ngừa thai, thuốc lợi tiểu nhóm thiazid, diazoxid [7] 1.1.3. Phân loại ĐTĐ có hai thể bệnh chính: ĐTĐ týp 1 do tụy tạng không tiết insulin và týp 2 do giảm tiết insulin, đề kháng insulin. ĐTĐ týp 1: tế bào β của đảo Langerhans ở tụy không có khả năng tiết insulin, nguyên nhân do hệ thống miễn dịch của cơ thể tự tạo kháng thể tấn công tế bào β. Những triệu chứng điển hình của ĐTĐ týp 1 là: ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, sụt cân, trẻ em chậm phát triển và dễ bị nhiễm trùng. ĐTĐ týp 2: tế bào β vẫn tiết insulin nhưng không đủ để duy trì nồng độ đường huyết, tế bào đích giảm nhạy cảm với insulin. Bệnh nhân thường ít có triệu chứng và thường chỉ được phát hiện bởi các triệu chứng của biến chứng, hoặc chỉ được phát hiện tình cờ khi đi xét nghiệm máu trước khi mổ hoặc khi có biến chứng như: nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não, nhiễm trùng da kéo dài. 5 Bảng 1.1. Đặc điểm của bệnh đái tháo đường týp1 và týp 2 [5] ĐẶC ĐIỂM ĐTĐ TÝP 1 ĐTĐ TÝP 2 Tuổi khởi bệnh điển hình Liên hệ gen Tình trạng dinh dưỡng Tỷ lệ bệnh Kiểu xuất hiện bệnh Yếu tố làm xuất hiện bệnh Insulin huyết tương Biến chứng cấp tính Điều trị bằng insulin Điều trị bằng thuốc hạ đường dạng uống Trước 30 Nhiễm sắc thể số 6 Suy dinh dưỡng 10-20% Đột ngột Bất thường miễn dịch Không có, ít Nhiễm toan-ceton huyết Cần, bắt buộc Không đáp ứng Sau 30 Thường không xác định Béo phì 80-90% Từ từ Mập phì, cao tuổi Bình thường, cao, thấp Hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu Có khi cần Có đáp ứng 85 - 90% ĐTĐ thai kỳ: tình trạng rối loạn dung nạp glucose trong thai kỳ gặp ở 3 - 5% phụ nữ có thai. Tình trạng kháng insulin liên quan đến sự thay đổi chuyển hóa trong giai đoạn cuối thai kỳ làm tăng nhu cầu insulin có thể dẫn đến tăng đường huyết hay rối loạn dung nạp glucose. Đa số trở về bình thường sau khi sinh nhưng có nguy cơ đáng kể (30 - 60%) phát triển thành ĐTĐ sau đó. Các loại ĐTĐ khác: gồm ĐTĐ của người trẻ khởi phát ở tuổi