Khóa luận Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC THANH THẢO Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN NGUYỄN NGỌC THANH THẢO BSTY. HOÀNG THANH HẢI BSTY. LÊ HỒNG PHONG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Với tất cả lòng kính trọng và yêu thƣơng, con xin cảm ơn Ba Mẹ, Ngƣời đã cho con có ngày hôm nay.  Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô các Khoa, Bộ môn đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 4 năm học qua.  Xin chân thành cảm ơn ThS. Trần Thị Bích Liên đã tận tình dạy bảo, động viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập cũng nhƣ trong việc thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  Em xin chân thành cảm ơn BSTY Hoàng Thanh Hải, ngƣời đã luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận.  Xin chân thành cảm ơn BSTY Lê Hồng Phong đã hỗ trợ, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.  Xin chân thành cảm ơn cô Lê Thị Hà đã tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận.  Xin cảm ơn các bạn, những ngƣời đã chia sẽ mọi buồn vui với Thảo trong suốt 4 năm qua.  Em cảm ơn Anh…! Tp Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 9 năm 2007 Nguyễn Ngọc Thanh Thảo iv TÓM TẮT Đề tài: “CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ”, đƣợc thực hiện tại Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007. Nội dung: Thực hiện 2 quy trình trypsin để tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi và xác định tuổi phôi, quy trình tách tế bào thích hợp nhất. Nuôi cấy, cấy chuyển và theo dõi sự phát triển của tế bào sơ cấp, tế bào thứ cấp. Thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà trong Nitơ lỏng. Hồi phục và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản. Các kết quả thu đƣợc: Số lƣợng tế bào tách đƣợc từ phôi 9 và 10 ngày tuổi tƣơng đƣơng nhau và cao hơn số tế bào tách đƣợc từ phôi 8 ngày tuổi. Số tế bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin lạnh (49,73 x 106) cao hơn số tế bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin ấm (25,51 x 106). Độ tuổi phôi và quy trình tách tế bào không ảnh hƣởng đến sự phát triển của tế bào in vitro. Tế bào xơ phôi gà thứ cấp có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro cao hơn tế bào sơ cấp. Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi bảo quản trong Nitơ lỏng 5 ngày có khả năng bám và phát triển trên bề mặt bình nuôi cấy. v SUMMARY Graduating thesis topic: “IMPROVE THE PROCEDURE OF HARVESTING AND FREEZING CEF CELLS”. The thesis was carried out at Microbiology and Infectious Diseases Dept. of Faculty of Animal Science and Veterinary, Nong Lam university Ho Chi Minh city from 4/2007 to 8/2007. Contents of research: Trying 2 trypsin process for the culture of primary cells from embryonated eggs at 8 th , 9 th , 10 th day then define a trypsin process and an age of embryo for primary culture. Culture, subculture and observe the growth of the primary cells, the secondary cells. Harvesting and freezing CEF cells in liquid nitrogen. Reviving and surveying the survival of cells after cryoprotected. Result: The number of CEF cells were removed from 9th day embryo tantamount to those from 10 th day embryo and more than those from 8 th day embryo . The number of CEF cells were removed by cool trypsin process (49,73x106) more than those by warm trypsin process (25,51 x 10 6 ). The age of embryo and the trypsin process don’t affect the growth of in vitro cells. The secondary CEF cells can grow better than the primary CEF cells in in vitro. 5th day after cryoprotection, the secondary CEF cells can attach to the substrate and grow. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa 1 ........................................................................................................... i Trang bìa 2 .......................................................................................................... ii Lời cảm ơn ......................................................................................................... iii Tóm tắt tiếng Việt .............................................................................................. iv Tóm tắt tiếng Anh ............................................................................................... v Mục lục ............................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. ix Danh sách các hình .............................................................................................. x Danh sách các bảng ............................................................................................ xi Danh sách các biểu đồ ........................................................................................ xi Danh sách các sơ đồ ........................................................................................... xi 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1 1.2. Mục đích ................................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật ....... 3 2.2. Đặc điểm tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào ...... 5 2.2.1. Sự điều hòa trao đổi chất ................................................................ 6 2.2.2. Tính chất cơ học yếu ...................................................................... 7 2.2.3. Khả năng phân chia và tốc độ tăng trƣởng rất chậm ..................... 7 2.2.4. Cần giá đỡ trong quá trình phát triển và nhân đôi ......................... 8 2.2.5. Chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng ............................................................................................. 8 2.2.6. Khả năng tiếp nhận gene lạ ............................................................ 8 2.2.7. Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo ................................. 8 2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật ................................................... 9 vii 2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp .............................................................................. 9 2.3.2. Sự cấy chuyển ................................................................................ 9 2.3.3. Hệ thống nuôi cấy tế bào.............................................................. 10 2.3.3.1. Nuôi cấy lớp đơn ................................................................. 10 2.3.3.2. Nuôi cấy huyền phù ............................................................ 10 2.3.4. Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật ............................ 11 2.3.5. Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy.......................... 12 2.3.6. Điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật ....................... 13 2.3.7. Vấn đề cần lƣu ý khi nuôi cấy tế bào động vật ............................ 19 2.3.8. Các pha của sự nuôi cấy tế bào động vật ..................................... 19 2.3.8.1. Pha ức chế ........................................................................... 19 2.3.8.2. Pha phát triển ....................................................................... 19 2.3.8.3. Pha ổn định .......................................................................... 20 2.3.8.4. Pha suy giảm ....................................................................... 20 2.4. Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy ............................................................... 20 2.4.1. Những ƣu điểm của việc đông lạnh tế bào nuôi cấy .................... 20 2.4.2. Tiến trình bảo quản lạnh tế bào .................................................... 21 2.4.3. Một số vấn đề có thể ảnh hƣởng đến kết quả bảo quản ............... 22 2.5. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật ................................................ 22 2.5.1. Thiết lập hệ thống mô hình .......................................................... 23 2.5.2. Xét nghiệm độc tế bào ................................................................. 23 2.5.3. Nghiên cứu ung thƣ ...................................................................... 23 2.5.4. Virus học ...................................................................................... 23 2.5.5. Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào .............................................. 23 2.5.6. Chẩn đoán di truyền ..................................................................... 24 2.5.7. Kỹ thuật di truyền ........................................................................ 24 2.5.8. Liệu pháp gene ............................................................................. 25 2.5.9. Phát triển và chọn lọc thuốc ......................................................... 25 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 26 viii 3.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................ 26 3.1.1. Thời gian ...................................................................................... 26 3.1.2. Địa điểm ....................................................................................... 26 3.2. Vật liệu và hóa chất ............................................................................... 26 3.2.1. Đối tƣợng ..................................................................................... 26 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .................................................... 26 3.2.3. Các hóa chất và môi trƣờng ......................................................... 27 3.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 27 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 28 3.4.1. Kỹ thuật lấy phôi và tách mô ở phôi gà ....................................... 28 3.4.2. Phƣơng pháp tạo tế bào sơ cấp..................................................... 28 3.4.3. Phƣơng pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer ................. 29 3.4.4. Phƣơng pháp cấy chuyền tế bào................................................... 30 3.4.5. Phƣơng pháp bảo quản tế bào ...................................................... 31 3.4.6. Phƣơng pháp hồi phục tế bào ....................................................... 31 3.5. Chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................... 31 3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................... 31 3.7. Quy trình tiến hành thí nghiệm .............................................................. 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 33 4.1. Xác định tuổi phôi và phƣơng pháp tách tế bào thích hợp ................... 33 4.2.Thời gian tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp ..................................... 35 4.3. Cấy chuyển, thu hoạch, bảo quản tế bào và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản .......................................................................... 37 4.3.1. Thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp ................... 37 4.3.2.Xác định khả năng sống của tế bào sau bảo quản ......................... 39 4.4. Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà trong điều kiện Việt Nam .......... 41 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 43 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 44 7. PHỤ LỤC ...................................................................................................... 46 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CEF: Chicken Embryo Fibroblast. DMSO: dimethyl sulfoxide. EMEM: Eagle’s minimum essential medium. FBS: Fetal bovine serum. HEPES: N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulphonic acid. MEM: Minimum essential medium. PBSA: Phosphate bufferd saline solution A. x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Mô hình một tế bào động vật điển hình .............................................. 5 Hình 2.2: Các dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn ................................................ 10 Hình 2.3: Các dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào ........................................... 11 Hình 2.4: Ống bảo quản tế bào.......................................................................... 21 Hình 2.5: Bình Nitơ lỏng bảo quản tế bào ........................................................ 22 Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer........................................................................ 29 Hình 3.2: Tế bào CEF trong buồng đếm ........................................................... 30 Hình 4.1: Tế bào sơ cấp sau 15 giờ nuôi cấy .................................................... 36 Hình 4.2: Tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp ................................................ 36 Hình 4.3: Tế bào thứ cấp phát triển đầy một lớp .............................................. 38 Hình 4.4: Tế bào xơ phôi gà sơ cấp sau khi hồi phục ....................................... 40 Hình 4.5: Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi hồi phục ..................................... 40 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1: Số tế bào sống trung bình thu đƣợc từ các tuổi phôi và các phƣơng pháp tách tế bào ................................................................... 34 Bảng 4.2: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào sơ cấp (giờ) .................................................................................................. 35 Bảng 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp (giờ) .................................................................................................. 37 Bảng 4.4: Tỷ lệ tế bào sống sau khi phục hồi ................................................... 37 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1: Số lƣợng tế bào thu đƣợc từ các độ tuổi phôi và các phƣơng pháp tách tế bào ............................................................. 33 Biểu đồ 4.2: Thời gian trung bình làm đầy một lớp của tế bào sơ cấp ............. 35 Biểu đồ 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp ......................................................................................... 38 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3: Quy trình thực hiện thí nghiệm ........................................................... 32 Sơ đồ 4: Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà .................................................. 42 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Động vật cũng nhƣ nhiều loại sinh vật đa bào khác đƣợc cấu tạo từ các loại mô khác nhau. Các mô đƣợc cấu tạo từ những tế bào cùng loại. Nhƣ vậy, tế bào là đơn vị cấu trúc nhỏ nhất của một cơ thể, là đơn vị chức năng cơ bản của sự sống. Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào ở thực vật và động vật. Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có những nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc với mục đích cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu sinh học, y học nhƣ: nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa, con đƣờng trao đổi chất, kiểm tra ảnh hƣởng của các chất lên từng tế bào riêng biệt, nghiên cứu sản xuất mô nhân tạo, tổng hợp các chất sinh học nhƣ vaccine, hormone… Trên thế giới, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn rất dài tìm hƣớng đi về kỹ thuật, tìm môi trƣờng tƣơng ứng và đang bƣớc vào giai đoạn sản xuất theo quy mô công nghiệp ở giai đoạn vừa và nhỏ. Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật vẫn chƣa phát triển, đa số tế bào nuôi cấy đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài. Tế bào phôi gà là loại tế bào có khả năng phát triển và sinh sản rất cao, dễ dàng bám vào bề mặt bình nuôi cấy và môi trƣờng nuôi không cần nồng độ huyết thanh cao nhƣ các dòng tế bào khác (ví dụ các tế bào tách từ phôi chuột, các dòng tế bào ung thƣ…) (Phan Kim Ngọc, 2002). Do đó, việc sản xuất tế bào xơ phôi gà trong điều kiện ở Việt Nam là hoàn toàn có khả năng thực hiện đƣợc nhằm phục vụ cho chẩn đoán, sản xuất vaccine gia cầm trong tình hình hiện nay, cũng nhƣ làm nền tảng cho những nghiên cứu sau này. 2 Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đƣợc sự phân công của bộ môn Vi sinh- Truyền nhiễm, khoa Chăn nuôi - Thú y, dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Trần Thị Bích Liên, BSTY Hoàng Thanh Hải, BSTY Lê Hồng Phong, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà”. 1.2. Mục đích Xây dựng quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà phù hợp với điều kiện tại Việt Nam, từ đó mở rộng khả năng ứng dụng tế bào xơ phôi gà trong nghiên cứu, chẩn đoán bệnh, sản xuất vaccine cho gia cầm. 1.3. Yêu cầu - Tiến hành tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi bằng cách sử dụng hai quy trình trypsin ấm và trypsin lạnh. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần. - Khảo sát số lƣợng tế bào thu đƣợc, thời gian tạo một lớp tế bào và khả năng sống của tế bào sau thời gian bảo quản tronng Nitơ lỏng. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan (1838) là nền tảng cho nhiều nhà khoa học về thực vật và động vật bắt đầu nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc (tế bào mầm). Mặt khác, thực tế cuộc sống đòi hỏi vấn đề nuôi tế bào động vật ngày càng trở nên cấp bách. Trƣớc đây, ngƣời ta nuôi cấy virus trong cơ thể một sinh vật chủ. Từ đó, ngƣời ta thu nhận virus và dùng nó để sản xuất vaccine. Việc sản xuất vaccine theo phƣơng pháp này đã có những kết quả rất tốt và đóng vai trò rất quan trọng trong phòng và chữa bệnh hàng chục năm qua. Hiện nay, ngƣời ta vẫn áp dụng có hiệu quả phƣơng pháp này để sản xuất vaccine cho ngƣời và gia súc. Tuy nhiên, việc sản xuất vaccine theo phƣơng pháp này vẫn có những hạn chế cần khắc phục. Trong đó, khó khăn nhất là phải sử dụng một số lƣợng lớn động vật cho quá trình nuôi virus. Điều đó không chỉ khó khăn về mặt kỹ thuật mà còn khó khăn về tài chính. Việc nuôi cấy tế bào động vật đặt ra cho các nhà khoa học những thách thức không nhỏ. Bởi lẽ, nuôi cấy tế bào động vật khó hơn nhiều so với nuôi cấy vi sinh vật và nuôi cấy tế bào thực vật. Kiến thức tổng quát cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đƣợc đƣa ra từ thế kỷ 19. Năm 1855, Roux chứng minh đƣợc khả năng giữ toàn vẹn đặc tính sinh học của tế bào phôi gà trong dung dịch nƣớc muối sinh lý. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong nhận thức về sự sống của tế bào ngoài cơ thể, nó mở ra khả năng phát triển sự sống bên ngoài cơ thể đa bào. 4 Đến năm 1907, Ross Harrison đã tách thành công tế bào thần kinh ếch để làm thí nghiệm thử nuôi chúng ngoài cơ thể. Nhƣng cho đến