Khóa luận Đánh giá hiệu quả tác dụng của một vài hợp chất tự nhiên chiết xuất từ thảo mộc trong điều trị bệnh phát sáng do vibrio harveyi trên tôm sú (penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH NGHI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÝ THỊ THANH LOAN NGUYỄN ĐÌNH NGHI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong trường Đại học Nông Lâm đã trang bị cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt bốn năm đại học giúp tôi có đủ khả năng để hoàn thành khóa luận này. Tiếp theo, tôi vô cùng cảm ơn cô Lý Thị Thanh Loan đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn chị Uyên cán bộ nghiên cứu trong phòng Vi khuẩn của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã tận tình hướng dẫn tôi trong phần tiến hành các thí nghiệm. Đồng thời, tôi xin cảm ơn các anh chị trong phòng Vi khuẩn đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện khoá luận. Sau cùng, tôi xin cảm ơn các bạn của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như đã động viên, khuyến khích tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện khóa luận. TÓM TẮT NGUYỄN ĐÌNH NGHI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 7/2005. “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHIẾT SUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon).” Hội đồng hướng dẫn: TS. LÝ THỊ THANH LOAN Đề tài được thực hiện trên đối tượng là vi khuẩn Vibrio harveyi, được xem là một mầm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng ở tôm. Chúng thường gây ra tỷ lệ chết cao đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng của tôm, có thể lên đến 100%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp làm kháng sinh đồ để sàng lọc, tìm ra một hợp chất thảo dược có hiệu quả chống lại V. harveyi trong phòng thí nghiệm, kết hợp với việc bố trí thí nghiệm để kiểm tra tính hiệu quả thực tế của các loại hợp chất thảo dược này ngay trên tôm nuôi. Những kết quả đạt được: Sàng lọc và chọn ra được một hợp chất có hiệu quả chống lại V. harveyi tốt nhất trong bốn hợp chất thảo dược thử nghiệm (B2, L, L2 và M) là M. Hợp chất M cho hiệu quả tốt kháng được V. harveyi và giúp giảm tỷ lệ chết ở tôm khi cho tôm bệnh ăn thức ăn có trộn với hợp chất M ở nồng độ 500 và 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Quan sát kết quả bước đầu cho thấy hợp chất này không ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của tôm. ABSTRACT NGUYEN DINH NGHI, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, July/2005. “EVALUATE THE EFFECT OF NATURAL SUBSTANCES EXTRACTED FROM HERBS IN CURING VIBRIOSIS (Vibrio harveyi) ON BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon). Guiding council: Dr. LY THI THANH LOAN The subject was studied on V. harveyi, has recognized as a devastating pathogen of shrimp. V. harveyi usually result in up to 100% mortality in larvae and postlarvae of Penaeus shrimp. In this research, A antibiogram method was used to screen herbal compounds possess antimicrobial activity against V. harveyi in vitro, combine with disposing experiments to test effectivity of herbal compounds on shrimp in vivo. Results: M compound was found out a highest effective compound against V. harveyi among 4 herbal compounds (L, L2, M and B2 compounds). M herbal compound showed activity against V. harveyi and decreased mortality of shrimp when shrimp fed on diets supplemented with 500 and 750 mg/kg body weight/day of M compound. And this compound didn’t have any damaging effect to the growing of shrimp. MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii TÓM TẮT .................................................................................................................. iv ABSTRACT ................................................................................................................. v MỤC LỤC .................................................................................................... vi, vii, viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ ix DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ x DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... xi Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài ...................................................................................................... 2 1.3. Nội dung ............................................................................................................... 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nuôi tôm ............................................................................................... 3 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới ............................................................... 3 2.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam ................................................................ 6 2.1.3. Tình hình và thiệt hại của bệnh do Vibrio gây ra ...................................... 9 ở tôm trên thế giới và tại Việt Nam 2.2. Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi gây ra trên tôm ............................................. 10 2.2.1. Đặc điểm của Vibrio harveyi ................................................................... 10 2.2.2. Dấu hiệu bệnh .......................................................................................... 13 2.2.3. Điều kiện phát sinh bệnh ......................................................................... 14 2.2.4. Khu vực phân bố bệnh ............................................................................ 14 2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh phát sáng trên tôm ....................................... 15 2.3.1. Phương pháp vi khuẩn học ...................................................................... 15 2.3.2. Phương pháp mô học ............................................................................... 15 2.3.3. Phương pháp miễn dịch học .................................................................... 15 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .……........................... 15 2.4. Một số loài thảo dược có tiềm năng trong việc điều trị ...................................... 16 bệnh phát sáng trên tôm 2.4.1. Nhục đậu khấu ........................................................................................ 17 2.4.2. Cây Neem ................................................................................................ 18 2.4.3. Hương nhu tía .......................................................................................... 18 2.4.4. Cây sả ...................................................................................................... 19 2.4.5. Cây ổi ...................................................................................................... 20 2.5. Các hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc ................................... 21 ngăn chặn dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm trong tương lai 2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn ................................ 22 đoán phát hiện bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm 2.5.2. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo ................................... 22 ra các chế phẩm dùng trong ngăn chặn và điều trị bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm ......................................................................................... 26 3.1.1. Thời gian ................................................................................................. 26 3.1.2. Địa điểm .................................................................................................. 26 3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 26 3.2.1. Vật liệu .................................................................................................... 26 3.2.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 26 3.2.3. Dụng cụ và hóa chất ................................................................................ 26 3.2.3.1. Dụng cụ ........................................................................................ 26 3.2.3.2. Môi trường và hóa chất ................................................................ 27 3.3. Phương pháp tiến hành ....................................................................................... 27 3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm ........................................ 27 3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi ............................................ 28 3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ ......................................................... 29 theo phương pháp Mc Farland 3.3.2. Thử nghiệm trong phòng ướt Wet-lab .................................................... 30 3.3.2.1. Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá ...................................... 32 lý của nước nuôi 3.3.2.5. Tiến hành thu mẫu và kiểm tra vi khuẩn ..................................... 33 3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu thống kê ................................................. 34 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm .......................................... 36 4.1.1 Kết quả phân lập dòng thuần Vibrio harveyi ................................ 36 4.1.2. Kết quả thí nghiệm kháng sinh đồ ............................................... 37 4.1.3. Kết quả thử nghiệm hợp chất M .................................................. 37 4.2. Kết quả thử nghiệm trong phòng Wet-lab .............................................. 40 4.2.1. Kết quả kiểm tra tính chất hoá lý của nước nuôi ......................... 40 4.2.2. Kết quả bố trí thí nghiệm ............................................................. 40 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 43 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 45 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 50 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHIA: Brain Heart Infusion Agar COD: Chemical Oxygen Demand Ctv: cộng tác viên DMSO: Dimethyl Sulphoxide DNA: Deoxyribonucleic acid DO: Dissolved Oxygen ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assays FAO: Food and Agriculture Organization MBV: Penaeus monodon Baculovirus MHA: Mueller Hinton Agar O/F: Oxidation/Fermentation test PCR: Polymerase Chain Reaction TCBS: Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar TSB: Tryptone Soya Broth VP: Voges Proskauer WSSV: White Spot Syndrome Virus YHV: Yellow Head Virus LD: Lethal Dose DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Đặc điểm sinh hóa học của V. harveyi ...................................................... 12 Bảng 3.1. Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí ............................... 29 nghiệm Mc Farland Bảng 4.1. Kết quả các phản ứng sinh hoá định danh Vibrio harveyi ....................... 36 Bảng 4.2. Kết quả tác dụng của các hợp chất ở các khoảng thời gian ...................... 37 Bảng 4.3. So sánh hiệu quả của hợp chất M qua các khoảng thời ............................ 38 gian ở từng nồng độ thử nghiệm Bảng 4.4. So sánh hiệu quả giữa các nồng độ sau các khoảng thời .......................... 39 gian đối với V. harveyi Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra các tính chất hóa lý của nước nuôi tôm ........................ 40 Bảng 4.6. Tỷ lệ tôm chết (%) ở các lô thử nghiệm ................................................... 41 Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra mẫu nước và mẫu tôm của các bể thí ........................... 42 nghiệm DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1. Khuẩn lạc V. harveyi phát sáng trong tối .................................................. 11 Hình 2.2. Lá và hạt cây Neem ................................................................................... 18 Hình 2.3. Cây sả ........................................................................................................ 19 Hình 2.4. Cành và quả ổi ........................................................................................... 20 Hình 4.1. Kết quả kháng sinh đồ của hợp chất M ..................................................... 40 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nghề nuôi tôm trên thế giới đã có từ rất lâu nhưng nghề nuôi tôm hiện đại chỉ thực sự ra đời kể từ những năm 1930, khi các nhà khoa học Nhật Bản sản xuất được tôm giống nhân tạo. Nghề nuôi tôm cũng chỉ thực sự bùng nổ từ những năm 80 khi tôm giống đã được sản xuất ra với một số lượng lớn để cung cấp cho người nuôi (Trần Văn Vỹ và ctv, 1993). Nhưng hiện nay nhiều nơi trên thế giới, nghề nuôi tôm đang bị gây trở ngại bởi nạn dịch bệnh lay lan khắp nơi. Các dịch bệnh thường hay xảy ra đối với tôm là bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh MBV, bệnh do Vibrio, nấm… gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm. Một trong các bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là bệnh do vi khuẩn phát sáng thuộc nhóm Vibrio, trong đó đáng chú ý là Vibrio harveyi. Chúng có thể gây bệnh qua tất cả các giai đoạn của tôm nuôi và được xem là nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng trên tôm giống ở các trại sản xuất. Nhiều trường hợp nhiễm bệnh đã được phát hiện ở Australia, Ecuador, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan và Thái Lan trên nhiều giống tôm khác nhau. Các sự giảm sút gần đây trong nghề nuôi tôm ở Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines và Trung Quốc chủ yếu là do sự tác động của Vibrio (Fraser, 2005). Tôm nhiễm bệnh phát sáng do V. harveyi thường có các dấu hiệu biến ăn, bơi yếu, cơ thể chuyển sang màu trắng đục, có thể phát sáng và xuất hiện những vùng thoái hóa mô gan. Mật độ tôm thả nuôi cao, thức ăn giàu protein, môi trường ương trứng dưới mức thuận lợi đã tạo môi trường lý tưởng cho V. harveyi và gây ra tỷ lệ chết cao có thể lên đến 100% (Fraser, 2005). Hiện nay có nhiều cách để ngăn chặn bệnh phát sáng trên tôm như sử dụng kháng sinh, dùng hoá chất để xử lý ao nuôi và sử dụng chế phẩm sinh học. Tuy nhiên do các mặt hạn chế và hiệu quả sử dụng của chúng không cao nên để giảm thiệt hại của bệnh phát sáng, người nuôi vẫn sử dụng các biện pháp phòng ngừa là chủ yếu. Nhiều nghiên cứu để tìm ra các biện pháp mới ngăn chặn bệnh phát sáng đã được tiến hành, trong đó người ta đã tìm ra được nhiều chất có nguồn gốc sinh học hứa hẹn nhiều tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Tuy nhiên các hợp chất này vẫn đang còn trong giai đoạn nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Để có thể đưa vào ứng dụng trong sản xuất cần phải tiến hành nhiều thí nghiệm kiểm tra hiệu quả của chúng trong việc điều trị bệnh trên tôm. Hiện tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có nhiều tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Bước tiếp theo trong nghiên cứu là đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất đó trong việc điều trị trước khi đưa ra ứng dụng thực tế trong sản xuất. Đây cũng chính là nội dung thực hiện đề tài khóa luận, “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHIẾT SUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon).” 1.2. Mục tiêu đề tài Đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn do Vibrio harveyi gây ra trên tôm sú (Penaeus monodon). 1.3. Nội dung Phân lập dòng V. harveyi thuần trên mẫu tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn. Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất chiết suất từ thảo dược đối với vi khuẩn V. harveyi bằng phương pháp kháng sinh đồ. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất thử nghiệm đối với V. harveyi gây bệnh trên tôm. Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nuôi tôm 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới Lịch sử nuôi cá và các loại thủy sản đã có từ rất lâu. Những tài liệu sớm nhất ghi chép về hoạt động nuôi trồng thủy sản ở Trung Quốc vào thế kỷ XII trước Công nguyên. Vào thế kỷ XV, cá Măng và các loài thủy sản khác bao gồm cả tôm biển được nuôi phổ biến trong những đầm nước lợ diện tích lớn tại Indonesia (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Nhưng nhìn chung nghề nuôi tôm chỉ mới bắt đầu phát triển nhanh từ những năm đầu thập kỷ 80 của thế kỷ XX và có thể chia nghề nuôi tôm trên thế giới thành 3 giai đoạn chính như sau (Nguyễn Thanh Phương, 2004): - Giai đoạn 1: Giai đoạn nghiên cứu và phát triển sau đó là sự phát triển nhảy vọt (từ những năm 60 đến những năm 80). Trong giai đoạn này tôm chủ yếu được nuôi quãng canh ven biển hoặc có thể là sản phẩm phụ của các ao nuôi cá măng, cá đối như ở Đài Loan, Philippines, Indonesia… Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để cải tiến các kỹ thuật nuôi làm cơ sở phát triển cho nghề nuôi tôm sau này. - Giai đoạn 2: Nghề nuôi tôm gặp nhiều khó khăn (từ những năm 80 đến những năm 90). Giai đoạn này có nhiều trở ngại xảy ra liên quan đến bệnh tật, suy thoái tài nguyên, ô nhiễm môi trường và mâu thuẫn về kinh tế xã hội. - Giai đoạn 3: Nghề nuôi tôm hiện nay và tương lai. Do những trở ngại trên, xu hướng hiện nay và trong thời gian tới là nuôi tôm theo hướng bền vững với sự đa dạng hóa đối tượng nuôi, cải thiện qui hoạch và quản lý trong phát triển. Dựa vào quy mô và kỹ thuật nuôi có thể chia các hình thức nuôi tôm thành 3 loại hình chính: quãng canh, bán công nghiệp và công nghiệp. Hình thức nuôi tôm quãng canh có trước tiên, hình thức nuôi này dựa hoàn toàn vào nguồn tôm giống và thức ăn có trong tự nhiên trong diện tích đầm nuôi lớn để thu sản phẩm. Đây là hình thức nuôi đạt năng suất thấp nhất. Do nhu cầu thị trường của con tôm tăng và những tiến bộ đạt được trong sản xuất giống tôm, hình thức nuôi tôm bán công nghiệp có thả giống và cho ăn bổ sung được hình thành vào khoảng hai thập niên qua, đạt được năng suất cao hơn. Gần đây, nuôi tôm công nghiệp được sự hổ trợ của công nghệ sinh học, trở thành nguồn cung cấp tôm chủ yếu cho thị trường xuất khẩu (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Trên thế giới có hai khu vực nuôi tôm lớn: Tây bán cầu gồm các nước châu Mỹ La Tinh và ở Đông bán cầu gồm các nước Nam và Đông Nam Á. Năm 1997 khu vực Tây bán cầu, Ecuador đạt 130.000 tấn (diện tích nuôi là 180.000 ha), chiếm 66% tổng lượng tôm nuôi của khu vực. Cũng trong năm này, sản lượng tôm nuôi của khu vực Đông bán cầu đạt 462.000 tấn chiếm 70% tôm nuôi trên thế giới. Thái Lan là nước đứng đầu với sản lượng 150.000 tấn (diện tích nuôi 70.000 ha) chiếm 32,5% sản lượng của khu vực, kế đến là Indonesia, Trung Quốc, Ấn Độ, Bangladesh và Việt Nam (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Mặc dù bắt đầu muộn nhưng có thể nói nghề nuôi tôm đã phát triển khá nhanh và dần dần đã trở thành một ngành kinh tế quan trọng ở vùng ven biển của nhiều quốc gia. Nhìn chung, ở các quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển, diện tích nuôi tôm ngày càng được mở rộng. Một ví dụ điển hình là tại Trung Quốc, năm 1991, tổng diện tích nuôi là 140.000 ha, năm 1997 diện tích nuôi tăng lên 160.000 ha (Nguyễn Văn Hảo, 2000) và đến năm 2001 diện tích nuôi của Trung Quốc là 230.000 ha (Shenzhen, 2002). Theo số liệu của FAO, năm 2003 tổng sản lượng tôm nu