Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm biển (avicennia marina) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật rapd

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ ĐỨC TUÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI MINH TRÍ LÊ ĐỨC TUÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn ba mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài. Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học. Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận. Thầy Bùi Minh Trí, đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu. Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh, chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Xin cám ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học. Xin chân thành cảm ơn! LÊ ĐỨC TUÂN iii TÓM TẮT LÊ ĐỨC TUÂN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ. Cây mắm biển (Avicennia marina) là một trong những loài thực vật đặc trƣng sinh sống ở rừng ngập mặn đem lại giá trị kinh tế và môi trƣờng rất cao.Tuy nhiên, những thập niên trở lại đây loài mắm biển có dấu hiệu lụi tàn. Vì vậy việc xây dựng chiến lƣợc phát triển lâu dài đem lại hiệu quả kinh tế và môi trƣờng cao, vấn đề đánh giá tổng quát quỹ gene và mức độ đa dạng của quần thể mắm tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh đƣợc xem là một việc làm cấp thiết. Sau một thời gian thực tập ở Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, chúng tôi đã đạt đƣợc kết quả: - Thu thập đƣợc 52 mẫu lá mắm với những đặc điểm hình thái khác nhau. - Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu lá mắm. - Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá mắm, ly trích tốt 47/52 mẫu - Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm. Qua thử nghiệm trên ba primer: primer 1 và primer RAH8 và primer OPAC10 thì thấy primer OPAC10 cho sản phẩm thể hiện sự đa dạng về di truyền cao. - Kết quả chạy RAPD với primer 1 chỉ cho 1 band đồng hình kích thƣớc 400 bp cho cả ba loài mắm, giúp xác định đƣợc marker chỉ thị cho loài mắm (Avicenniaceae). - Kết quả chạy RAPD với primer OPAC10 cho trung bình 6 band/mẫu. Số lƣợng band/mẫu không cao nhƣng lại thể hiện rõ sự đa hình giữa các mẫu. Chúng iv tôi thu đƣợc 9 band đa hình chiếm tỷ lệ 90% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 10%. Kết quả phân tích trên phần mềm NTSYS (Numercial Taxonomy System) phiên bản 2.1, 7 mẫu mắm đƣợc khảo sát đƣợc chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách phân nhóm là 0,40. Nhóm 1 gồm 4 mẫu: M8, M18, M25, M40. Các cây này có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,67 – 1,00. v MỤC LỤC Chƣơng Trang Trang tựa .............................................................................................................. ii Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt ................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... viii Danh sách các hình ............................................................................................... ix Dang sách các bảng .............................................................................................. x Chƣơng 1 LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................... 1 1.2 Mục đích, yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích ..................................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ....................................................................................................... 2 1.2.3 Hạn chế của đề tài ..................................................................................... 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học ........................................................ 3 2.1.1 Đa dạng sinh học ......................................................................................... 3 2.1.2 Đa dạng di truyền ........................................................................................ 3 2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền .......................................... 4 2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................... 4 2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ......................................... 4 2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ rừng ngập măn Cần Giờ ....................................... 8 2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............ 9 2.3 Cây mắm biển.......................................................................................... 11 vi 2.3.1 Hình thái học ........................................................................................... 11 2.3.2 Nơi sống và sinh thái............................................................................... 12 2.3.3 Phân bố .................................................................................................... 12 2.3.2. Quy trình ly trích DNA thực vật ............................................................... 13 2.4.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .................................... 14 2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di .................................. 15 2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền.......................................... 16 2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử ................ 16 2.5.1.1 Chỉ thị hình thái ....................................................................................... 17 2.5.1.2. Chỉ thị isozyme ....................................................................................... 17 2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA ................................................................. 18 2.5.2 Kỹ thuật PCR .......................................................................................... 18 2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR ......................................................................... 18 2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR........................................................ 19 2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR ....................................................................... 21 2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) ........... 22 2.5.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ..................... 22 2.5.4.1 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD .................................................................. 25 2.5.4.2 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD ............................................................ 25 2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD ................................................................ 25 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ........................... 27 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................. 27 3.1.1 Thời gian nghiên cứu .............................................................................. 27 3.1.2 Địa điểm thực hiện .................................................................................. 27 3.2 Vật liệu thí nghiệm .................................................................................. 27 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 27 vii 3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA ........................................................... 27 3.3.2 Quy trình ly trích DNA ............................................................................. 31 3.3.3 Kiểm tra kết quả ly trích DNA .................................................................. 33 3.3.4 Thực hiện kỹ thuật RAPD ......................................................................... 34 3.3.4.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD.................................... 34 3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 35 3.4 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS ............................................. 38 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 40 4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm tại rừng ngập mặn Cần Giờ ........................ 40 4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA ............................. 41 4.2.1 Bảo quản mẫu .......................................................................................... 41 4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích ................................................................... 41 4.3 Kết quả chạy RAPD ................................................................................ 43 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 1 ...................... 43 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1 với chu kỳ ở Bảng .............................. 44 4.3.3 Thí nghiiệm 3 .......................................................................................... 45 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 48 5.1.1 Kết luận ..................................................................................................... 48 5.1.2 Đề nghị ...................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 50 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 52 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair CNMT: Công Nghệ Môi Trƣờng CNSH: Công Nghệ Sinh Học DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxynucleotide triphosphate E: East EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid EtBt: Ethidium bromide N: North. OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature TE: Tris EDTA. TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA. UNESCO: United Nations Educational Scientific, and Cultural Organization UV: Ultra Violet ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................ 5 Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm ........................................................ 11 Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR ........................................................ 21 Hình 2.4: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền ........................................................................................................ 25 Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) ........................................................... 41 Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ ................................................ 42 Hình 4.3: Kết quả ly trích theo quy trình 1 .................................................... 44 Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) ........ 44 Hình 4.5: Kết quả PCR ở thí nghiệm 1 .......................................................... 45 Hình 4.6: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 2 ....................................................... 46 Hình 4.7: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 3 ....................................................... 47 Hình 4.8 : Cây phân nhóm một số cây mắm biển tại khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ ........................................................................................................ 48 x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose có nồng độ khác nhau ...................................................................................................................... 16 Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide có nồng độ khác nhau ...................................................................................................................... 16 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 36 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 .......................... 36 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm2 . 37 Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 .......................... 37 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm3 38 Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 .......................... 38 1 Chƣơng 1 LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Mắm biển (Avicennia marina) là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn, phân bố rộng khắp trên toàn thế giới trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến [17]. Sau 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn vào ngày 21/01/2000 [18]. Ở nƣớc ta, cây mắm thƣờng sống ở những vùng rừng ngập mặn nhƣ Cần Giờ, Long An, Củ Chi… dùng làm liệu xây dựng là cây có giá trị kinh tế và môi trƣờng rất cao. Gỗ mắm đƣợc sử dụng rộng rãi để xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than mắm cho nhiệt lƣợng cao và ít khói. Các khu rừng mắm có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở, sa mạc hoá, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển. Mặt khác, các khu rừng mắm là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã. Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, đƣợc sự hƣớng dẫn của TS. Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện đề tài “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRÊN QUẦN THỂ MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. 2 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích  Bƣớc đầu phân tích sự đa dạng di truyền của quần thể mắm từ các mẫu  Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây mắm biển.  Đánh giá về mặt di truyền quần thể mắm trồng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh.  Ứng dụng trong tuyển chọn giống mắm phục vụ cho việc tái tạo rừng ngập mặn trong tƣơng lai. 1.2.2 Yêu cầu  Thiết lập phƣơng pháp ly trích DNA và bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD thích hợp cho cây mắm biển.  Thu thập mẫu lá từ những cây mắm biển có tuổi khác nhau và có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, có màu sắc trái khác lạ…  Ly trích đƣợc DNA từ mẫu lá mắm với độ tinh sạch cao.  Thu thập đƣợc bằng kỹ thuật RAPD.  Vẽ cây phân loại loài bằng phần mềm NTSYS. 1.2.2 Hạn chế của đề tài  Chỉ nghiên cứu đa dạng di truyền của một vài quần thể ở rừng ngập mặn Cần Giờ  Không có đủ điều kiện để thu thập lƣợng mẫu lớn.  Chỉ tiến hành chạy RAPD trên 3 primer.  Thời gian thực hiện từ 20/04/2007 đến 30/08/2007. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học 2.1.1 Đa dạng sinh học Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên - WWF (Word Wildlife fund) (1989), đa dạng sinh học đƣợc định nghĩa nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là các gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại trong môi trƣờng”. Do vậy đa dạng sinh học đƣợc xem xét theo 3 mức độ:  Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất, từ vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm.  Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các quần thể sống cách ly về địa lý cũng nhƣ các cá thể cùng chung sống trong một quần thể.  Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng nhƣ các quần xã sinh vật tồn tại và cả sự khác biệt của mối tƣơng quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình Quyền, 2002).  Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý. Đây là sự phân biệt có tầm rộng và là chiến lƣợc nghiên cứu của nhiều nƣớc trên thế giới. 2.1.2 Đa dạng di truyền Các cá thể trong một quần thể thƣờng có genome khác nhau. Sự đa dạng về genome đƣợc biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể. Những alen khác nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể khác nhau là khác nhau. Những cây trồng đƣợc trồng lai ghép hay những động vật đƣợc lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng, 4 vật nuôi cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt (Richard B. Primack, 1999). Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp do đột biến. Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thích nghi hơn với những thay đổi môi trƣờng (Richard B. Primack, 1999). 2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và nó cũng quan trọng đối với con ngƣời. Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng. Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời. 2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần Giờ, đƣợc hình thành ở hạ lƣu sông Đồng Nai-Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành Phố Hồ Chí Minh có toạ độ địa lý nhƣ sau: Vĩ độ Bắc: 100 22’14’’ - 100 37’39’’ Kinh độ Đông :1060 46’12’’ – 1070 00’59’’ Ngày đƣợc UNESCO công nhận: 21/01/2000. Tổng diện tích: 71.370 ha. Dân số: 57.403ngƣời. Tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,Tp. Hồ Chí Minh