Khóa luận nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne (ananas comosus) bằng phương pháp rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHONG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER LIÊN KẾT TÍNH KHÁNG BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE (Ananas comosus) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN HỒNG PHONG CN. LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Lê Đình Đôn đã hƣớng dẫn và góp ý cho tôi khi tiến hành chủng rệp tại nhà lƣới. - CN. Hồ Việt Thế và các anh chị phụ trách phòng CNSH thực vật thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh - Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ trong suốt thời gian ở phòng thí nghiệm. - Chị Tôn Bảo Linh, chị Biện Thị Lan Thanh đã góp ý và giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài. - Toàn thể lớp CNSH29 đã hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. - Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên để con đạt đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay. Tháng 9 năm 2007 Nguyễn Hồng Phong iv TÓM TẮT NGUYỄN HỒNG PHONG – Lớp DH03SH, Đại học Nông Lâm Tp. HCM. Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phƣơng pháp RAPD” dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đƣợc thực hiện tại Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh và khu nhà lƣới bảo vệ thực vật khoa Nông học Đại học Nông Lâm Tp. HCM. Nội dung nghiên cứu gồm: Đánh giá đa dạng di truyền các giống dứa Cayenne tại Tp. HCM bằng kỹ thuật RAPD. Nuôi rệp sáp và tiến hành lây nhiễm virus PMWaV thông qua vector là rệp sáp. Xác định marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne. Các kết quả thu đƣợc: Kết quả cây phân nhóm di truyền cho thấy giữa nhóm Cayenne và đối chứng Queen có hệ số tƣơng đồng là 0,9. Nhóm dứa Cayenne phân thành 2 nhóm nhỏ: nhóm 1 gồm 2 giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan, nhóm 2 là giống Lâm Đồng. Mức tƣơng đồng giữa 2 nhóm khoảng 0,92. Kết quả kiểm tra độ tin cậy bằng phần mềm winboot cho thấy cây phân nhóm di truyền tạo ra là có độ tin cậy cao nhất. Kết quả nuôi rệp sáp cho thấy rệp có thể phát triển tốt trên bí đỏ và trong điều kiện 25-26oC rệp phát triển tốt hơn trong điều kiện 33-34oC. Đã lây nhiễm đƣợc bệnh héo đỏ đầu lá lên dứa Cayenne với tỷ lệ 35,66% cây có biểu hiện bệnh. Chƣa phát hiện đƣợc marker liên kết rõ ràng với kiểu hình kháng bệnh héo đỏ đầu lá. v SUMMARY Studying genetic diversity and detect markers associated with resistance to wilt disease in cayenne pineapple by RAPD-PCR Supervisor: Tran Thi Dung 1 ; Luu Phuc Loi 1 , BSc Student: Nguyễn Hồng Phong1 1 Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city Cayenne pineapple is an important crop in Ho Chi Minh city for domestic consumption and export. But today most varietys have been plant is imports and have many pests, especially wilt disease. To develop pineapple industry of this area, its need to research genetic variation of varietys in this area and find the type of wilt resistance. In this study, we analysed genetic variation of 3 varietys of Cayenne pineapple in Ho Chi Minh city and found markers associated with wilt resistant trait by using 32 primer RAPD and received these results: - 6 primers gave DNA polymorphisms in 3 Cayenne varietys and 2 controls. OPAC10 have hightest allen number in Cayenne. UPGMA and bootstrap analysis on the basis of RAPD data clearly showed that 3 Cayenne varietys belong to two major clusters with 92% similarity. The first cluster includes Thailand and China varietys with 98% similarity. The Second cluster is Lam Dong variety. - The results of rearing mealybug show that mealybug can grow on pumpkin and the development of mealybug at 25 – 26oC is better than 33 – 34oC. - Two primers gave most DNA polymorphisms in pineapple when analysed genetic variation were used to detect marker associated with wilt resistant trait in Cayenne pineapple. But non marker was detected. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Summary ................................................................................................................ v Mục lục .................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... x Danh sách các hình và biểu đồ .............................................................................. xi Danh sách các bảng ............................................................................................ xiii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài ........................................................ 2 1.2.1. Mục tiêu ....................................................................................................... 2 1.2.2. Nội dung ....................................................................................................... 2 1.2.3. Yêu cầu ......................................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 2.1. Giới thiệu chung về cây dứa ........................................................................... 3 2.1.1. Phân loại và nguồn gốc ................................................................................ 3 2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa ............................................................... 3 2.1.2.1. Việt Nam .................................................................................................. 3 2.1.2.2. Thế giới ..................................................................................................... 4 2.1.3. Các nhóm dứa chính ..................................................................................... 5 2.1.3.1. Nhóm Queen ............................................................................................. 5 2.1.3.2. Nhóm Tây Ban Nha .................................................................................. 6 2.1.3.3. Nhóm Cayenne .......................................................................................... 7 2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị .................. 7 2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị .................................. 7 2.2.2. Chỉ thị hình thái ........................................................................................... 8 vii 2.2.3. Chỉ thị isozyme ............................................................................................ 8 2.2.4. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA ...................................................................... 9 2.2.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................ 10 2.3. Các phƣơng pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài ......................................... 11 2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam ............................................................... 12 2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới .......................................................................... 12 2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................................. 13 2.5. Bệnh héo do virus .......................................................................................... 14 2.5.1. Lịch sử phát hiện virus PMWaV ................................................................ 14 2.5.2. Tác nhân lây truyền bệnh ........................................................................... 16 2.5.3. Triệu chứng ................................................................................................ 18 2.5.4. Cách phòng trị ............................................................................................ 19 2.6. Marker liên kết tính kháng bệnh trên thực vật. ............................................. 20 2.6.1. Tính kháng bệnh trên thực vật ................................................................... 20 2.6.1.1. Kháng bệnh đơn gene (monogenic resistance) ....................................... 21 2.6.1.2. Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng ................. 21 2.6.2. Xác định marker phân tử liên kết gen kháng bệnh ở thực vật .................. 21 2.6.3. Một số nghiên cứu phát hiện marker phân tử cho tính kháng bệnh trên thực vật bằng kỹ thuật RAPD ...................................................................... 22 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 23 3.1. Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh .................................................................................................. 23 3.1.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 23 3.1.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 23 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................... 23 3.1.4. Hóa chất ..................................................................................................... 24 3.1.5. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 24 3.1.5.1. Ly trích DNA tổng số từ lá dứa .............................................................. 24 viii 3.1.5.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD .................................................................... 26 3.1.5.3. Thực hiện phản ứng RAPD .................................................................... 28 3.1.5.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot ........ 28 3.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne ......................................... 30 3.2.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 30 3.2.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 30 3.2.3. Dụng cụ ..................................................................................................... 30 3.2.4. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 31 3.2.4.1. Nuôi rệp ................................................................................................... 31 3.2.4.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh .............................................................. 31 3.2.4.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh .......................................... 32 3.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa Cayenne ....................................................................................... 33 3.3.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 33 3.3.2. Đối tƣợng ................................................................................................... 33 3.3.3. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 33 3.3.4. Hóa chất ..................................................................................................... 33 3.3.5. Phƣơng pháp .............................................................................................. 33 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 35 4.1. Đánh giá đa dạng di truyền của cây dứa Cayenne bằng kỹ thuật RAPD ...... 35 4.1.1. Kết quả ly trích DNA tổng số từ lá dứa ..................................................... 35 4.1.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD ....................................................................... 35 4.1.3. Thực hiện phản ứng RAPD ........................................................................ 36 4.1.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot ............ 40 4.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne ......................................... 43 4.2.1. Nuôi rệp ...................................................................................................... 43 4.2.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh ................................................................. 45 4.2.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh ............................................. 46 4.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo ix đỏ đầu lá trên dứa Cayenne .................................................................................. 48 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 52 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 52 5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 54 PHỤ LỤC x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT EB extraction buffer EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate OD Optical density OUT Operational Taxonomic Unit PCR Polymerase Chain Reaction PMWaV Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus QTL Quantivative Trait Locus RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris – Acetate – EDTA TE Tris – EDTA Tm Melting temperature xi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 2.1 Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD .............................. 10 Hình 2.2 Rệp sáp hồng (Dysmicoccus brevipes) và rệp sáp xám (D. neobrepes) ................................................................................................... 16 Hình 2.3 Cây dứa bệnh và không bệnh héo đỏ đầu lá ...................................... 18 Hình 2.4 Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá ...................................................... 19 Hình 2.5 Bọ rùa Cryptolaemus montrouzieri .................................................... 20 Hình 2.6 Ong bắp cày Anagyrus ananatis ........................................................ 20 Hình 3.1 Thả rệp lên bí ..................................................................................... 31 Hình 3.2 Dứa bệnh làm nguồn lây PMWaV ..................................................... 32 Hình 3.3 Vị trí thả rệp lên dứa sạch bệnh ........................................................ 33 Hình 4.1 Kết quả ly trích DNA dứa .................................................................. 35 Hình 4.2 Kết quả khảo sát nồng độ Taq polymerase ........................................ 36 Hình 4.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer ....................................................... 36 Hình 4.4 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAC10 ............................ 38 Hình 4.5 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPAH13 ............................ 38 Hình 4.6 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB01 ............................... 39 Hình 4.7 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPB08 ............................... 39 Hình 4.8 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer S1384................................. 40 Hình 4.9 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer V20 .................................... 40 Hình 4.10 Cây phân nhóm di truyền dựa vào kết quả RAPD ........................... 41 Hình 4.11 Độ tin cậy của các phân nhóm ........................................................ 42 Hình 4.12 Các kiểu phân nhóm khác ................................................................ 43 Hình 4.13 Rệp phát triển trên bí sau 1 tháng .................................................... 44 Hình 4.14 Chuyển Rệp bằng đèn ...................................................................... 45 Hình 4.15 Rệp phát triển trên dứa bệnh 1 tuần sau khi chủng .......................... 46 Hình 4.16 Rệp bám vào mặt sau lá dứa bệnh .................................................... 46 Hình 4.17 Rệp phát triển trên dứa sau khi chủng ............................................. 47 xii Hình 4.18 Dứa biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá. ................................................... 48 Hình 4.19 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPAC10 ................................................... 49 Hình 4.20 Kết quả phân tích RAPD các cây dứa biểu hiện và không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá với primer OPB08 ...................................................... 49 Biểu Đồ 4.1 Sự phát triển của rệp ở 25-26oC và 33-34oC (nhiệt độ phòng) ..... 44 xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Sản lƣợng dứa của 5 quốc gia trồng nhiều nhất ....................................... 4 Bảng 2.2 Quả tƣơi xuất khẩu ................................................................................... 5 Bảng 2.3 Quả tƣơi nhập khẩu ................................................................................... 5 Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ Taq polymerase .................. 27 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng RAPD. ........................................................... 27 Bảng 3.3 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ primer. ................................ 28 Bảng 4.1 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa và lan ............................. 37 Bảng 4.2 Số band khuếch đại và band đa hình giữa dứa Cayenne và dứa Queen . 37 Bảng 4.3 Hệ số đồng dạng di truyền của 3 giống dứa Cayenne và các đối chứng 41 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây dứa (Ananas comosus) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất đƣợc ƣa chuộng trên thế giới bởi hƣơng vị đặc trƣng và giàu dinh dƣỡng (vitamin, acid hữu cơ…). Trong các giống dứa chính, dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm của công nghệ chế biến đồ hộp nên đang đƣợc trồng rất phổ biến trên thế giới. Hiện nay, cây dứa nói chung và dứa Cayenne nói riêng đang nằm trong chƣơng trình cung cấp giống cây chất lƣợng cao của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí Minh. Để phát triển tốt hơn nữa ngành dứa ở vùng này thì điều trƣớc tiên là phải đánh giá đa dạng di truyền nguồn dứa để phục vụ công tác chọn giống và lai giống. Bên cạnh đó, cây dứa Cayenne có nhƣợc điểm chí