Khóa luận Phân biệt các loại thịt heo, bò, cừu bằng phương pháp multiplex pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ THANH HUYỀN Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Cô PGS.TS Trần Thị Dân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. KS. Lƣơng Quý Phƣơng, Trung tâm Phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm Đã tận tình hƣớng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. - Ban giám đốc, thầy cô và các cán bộ công chức Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . - Thầy Đinh Xuân Phát đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện khóa luận. Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 29 - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM đã luôn bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận. Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời, để con đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2007. Sinh viên: Trịnh Thị Thanh Huyền. TÓM TẮT KHÓA LUẬN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN, thực hiện khóa luận “Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR”. Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân KS. Lƣơng Quý Phƣơng Thời gian thực hiện từ tháng 2/2007 đến tháng 8/2007, tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Để tạo tiền đề trong việc giải quyết vấn đề gian lận thƣơng mại đối với sản phẩm thịt tƣơi và thịt chế biến, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành thiết lập quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt đã xử lý nhiệt ở nhiệt độ: 800C/15’, 120 0C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ với tỷ số OD trung bình là 2,0 (thịt tƣơi), 1,9 (thịt xử lý nhiệt)- tinh sạch, đạt tiêu chuẩn. 2) Sau khi tiến hành tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR bằng việc thử nghiệm nhiều quy trình (gồm quy trình của Matsunaga và ctv (1998) và các thử nghiệm điều chỉnh về thành phần hóa chất, nhiệt độ và thời gian của chu trình nhiệt, nồng độ mồi trong phản ứng), chúng tôi đã xác định đƣợc quy trình thích hợp, trong đó nồng độ MgCl2 2mM, lƣợng FSIM: RP: RB: RS lần lƣợt là 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, nhiệt độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính (940C/1phút), bắt cặp (540C/45giây), kéo dài (720C/1phút). 3) Sử dụng quy trình nultiplex PCR vừa tìm đƣợc đối với các hỗn hợp DNA của cả ba loài trong đó nồng độ DNA bò, cừu giảm dần và đã xác định đƣợc nồng độ của thịt cừu, bò mà quy trình này còn phát hiện đƣợc là 1ng/ l. 4) Chúng tôi tiếp tục thực hiện quy trình trên đối với các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau và rút ra kết luận là ở các nhiêt độ biến tính 80 0C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ vẫn còn phân biệt đƣợc ba loài trên. 5) Thực hiện quy trình trên với bột thịt của 3 hãng CE, A, VY, kết quả bột thịt của các hãng này có nguồn gốc lần lƣợt là: heo, bò, bò. SUMMARY TRINH THI THANH HUYEN in subject “Identifying meat of three meat species: pig, bovine, sheep by multiplex PCR” Suspervisors : PhD. Nguyen Ngọc Tuan BCs. Luong Quy Phuong To primarily resolve economic faudulent at meat products, we establish protocol to identify meat of three species (pig, bovine, sheep) by multiplex PCR. The results: 1) Extraction DNA from raw meats and heated meats (at temperatures: 80 0 C/15 min, 120 0 C/15 min, 120 0 C/30 min, 130 0 C/15 min), average ratio of OD were 2,0 (raw meat) and 1,9 ( heated meat) were pure, standard quality. 2) After optimizing procedures including protocol of Matsunaga et al.(1998) and changing volume of reaction, element of chemical, temperature and time of thermal cycle, concentration of primer), we established the suitable multiplex PCR protocol. This protocol was MgCl2 2 mM; concentration of primers FSIM: RP: RB: RS were 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, temperature and thermal cycle (denature 94 0 C/1 min, anealing 54 0 C/45 sec, elongation 72 0 C/1 min). 3) Aplying the multiplex PCR protocol to analyse mix DNA from three meat with descending concentration on bovine DNA and sheep DNA, the limits of DNA sample detected were 1ng/ l for bovine and sheep. 4) Using the protocol for mix heated meats to reach the conlusion that at processing temperatures: 80 0 C/15 min, 120 0 C/15min, 120 0 C/30 min, 130 0 C/15min the meats of pig, bovine, sheep were still identified. Meat and bone meal from three companies (CE, A, VY) were examined by the established protocol, the products of those company were meat from pig, bovine and bovine, respectively. MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa ............................................................................................................................. i Trang tựa .................................................................................................................. ii Lời cảm tạ ................................................................................................................ iii Tóm tắt khóa luận .................................................................................................... iv Summary .................................................................................................................. v Mục lục .................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... x Danh sách các bảng ................................................................................................. xi Danh sách các hình và biểu đồ .......................................................................................... xii Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Mục đích ............................................................................................................ 2 1.3 Yêu cầu .............................................................................................................. 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 3 2.1 Sơ lƣợc về thịt chế biến ..................................................................................... 3 2.1.1 Giới thiệu về thịt ......................................................................................... 3 2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến ........................................................................... 4 2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến ................................................ 4 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trƣờng thịt tƣơi và thịt chế biến của thế giới .......................................................................................................... 4 2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ động vật ở Việt Nam .................................................................................... 5 2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật ................................................................. 6 2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR ... 7 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt ........................................................... 8 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học ................................... 8 2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) ............................................................ 8 2.4.3 Protein array ................................................................................................ 9 2.4.4 Điện di 2 chiều ............................................................................................ 9 2.4.5. Giới thiệu chung về phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) ..... 10 2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR ....................................................................... 16 2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR ................................................................................. 16 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 18 3.1 Nội dung thực hiện .......................................................................................... 18 3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành ...................................................................... 18 3.3 Vật liệu ............................................................................................................ 19 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA ..................................................................... 19 3.3.2 Đoạn mồi................................................................................................... 19 3.3.3 Hóa chất .................................................................................................... 19 3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA ............................................. 19 3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di ........................................................... 19 3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR ............................................... 20 3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ ......................................................................... 20 3.4 Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................... 20 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu ................................................................................ 20 3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt .......................... 20 3.4.3 Tách chiết DNA ........................................................................................ 21 3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR ....................................................................... 22 3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR .................................................................... 24 3.4.5.1 Thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) ............................................................................................... 24 3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng ................................. 24 3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt ........................................... 24 3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng .................. 25 3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các nồng độ DNA khác nhau ................................................................................... 26 3.4.7 Thực hiện phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu .................. 27 3.4.8 S-PCR đối với DNA của thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 80 0C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút .......................... 27 3.4.9 M-PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau .................................................................................... 28 3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt ........................................................................... 28 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 29 4.1 Kết quả tách chiết ............................................................................................ 29 4.2 Kết quả s-PCR đối với thịt tƣơi thuần loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) .......................................................................................................... 31 4.3 Kết quả phản ứng m-PCR 3 loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) ............................................................................................................... 32 4.4 Kết quả quá trình thiết lập và tối ƣu hóa phản ứng m- PCR ........................... 33 4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng .................................................................... 33 4.4.2 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg2+ .......................................... 33 4.4.3 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt ......................................... 34 4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi ............................................ 36 4.4.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình ............................................. 38 4.5 Kết quả m-PCR đối với 2 loài ......................................................................... 39 4.6 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của DNA bò, cừu ................................................................................................................... 40 4.7 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt .................................................................. 40 4.8 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ...................................... 43 4.9 Kết quả m-PCR đối với bột thịt ....................................................................... 45 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 47 5.1 Kết luận ........................................................................................................... 47 5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 48 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 51 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2. 1. Tỉ lệ của các mô trong các loại thịt (%tính theo khối lƣợng thịt xẻ) ........ 3 Bảng 3. 1 Tỷ lệ các loại thịt trong các hỗn hợp thịt .................................................. 21 Bảng 3. 2 Thành phần hóa chất PCR ........................................................................ 23 Bảng 3. 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR ............................ 23 Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng .................................................................... 23 Bảng 3. 5 Thành phần hóa chất PCR ........................................................................ 24 Bảng 3. 6 Chu trình nhiệt của phản ứng trƣớc và sau khi điều chỉnh ....................... 25 Bảng 3. 7 Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm) .......................................................... 25 Bảng 3. 8 Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng) ........................................................... 26 Bảng 3. 9 Phối hợp DNA của heo và bò ở các nồng độ khác nhau .......................... 26 Bảng 3. 10 Phối hợp DNA của heo và cừu ở các nồng độ khác nhau ...................... 27 Bảng 3. 11 Thành phần các hỗn hợp DNA heo, bò, cừu .......................................... 27 Bảng 3. 12 Hỗn hợp thịt ở các nhiệt độ xử lý khác nhau .......................................... 28 Bảng 4. 1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA của thịt bò, heo, cừu ................................ 29 Bảng 4. 2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tách chiết từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt....... 30 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 4.1 Sản phẩm s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1999) ............... 32 Hình 4.2 Sản phẩm m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) .............. 33 Hình 4.3 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh thể tích phản ứng ................................ 34 Hình 4.4 Sản phẩm m-PCR sau khi tăng nồng độ Mg2+ ......................................... 35 Hình 4.5 Sản phẩm m-PCR khi điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp: 560C và 540C .......... 35 Hình 4.6 Sản phẩm m-PCR sau khi điều chỉnh chu trình nhiệt .............................. 36 Hình 4.7 Kết quả m-PCR khi giảm RS ................................................................... 38 Hình 4.8 Kết quả m-PCR khi tăng RP .................................................................... 38 Hình 4.9 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình ............................................ 39 Hình 4.10 Sản phẩm m-PCR đối với heo, bò .................................................................... 40 Hình 4.11 Sản phẩm m-PCR đối với DNA heo, cừu .............................................. 40 Hình 4.12 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp DNA ................................................. 41 Hình 4.13 Kết quả s – PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 800C/15 phút ................................. 42 Hình 4.14 Kết quả phản ứng s-PCR đối với thịt xử lý nhiệt ở 1200C/15 phút ....... 42 Hình 4.15 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1200C/30 phút ............................ 43 Hình 4.16 Sản phẩm s-PCR của thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút .......................... 43 Hình 4.17 Kết quả m-PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý ở nhiệt độ 800C/15 phút ..... 44 Hình 4.18 Kết quả m – PCR đối với hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở1200C/15 phút ...... 45 Hình 4.19 Kết quả m-PCR đối với hỗn hỗn hợp xử lý nhiệt 1200C/30 phút .......... 46 Hình 4.20 Kết quả m-PCR của các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở 1300C/15 phút ....... 46 Hình 4.21 Kết quả m-PCR của bột thịt ................................................................... 47 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4. 1 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt heo, bò, cừu .................. 290 Biểu đồ 4. 2 So sánh tỷ số OD và nồng độ DNA của thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt .. 301 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: base pair BSE :Bovine spongiform encephalopathy ctv: cộng tác viên DNA: deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: ethylene diamine tetra acetate ELISA: enzyme link imuno assay Lad: Ladder MBM: Meat and bone meal mtDNA : mitochondrial cytochrome b DNA m – PCR : multiplex PCR NST: nhiễm sắc thể OD: optical density PCR: polymerase chain reaction SDS: sodium dodecyl sulfate RNA: ribonucleic acid Taq: Taq polymerase TBE: Tris borate EDTA TE: Tris EDTA t. bò: thịt bò t. cừu: thịt cừu t. heo: thịt heo TN: Thí nghiệm Tỷ số OD: tỷ số OD260 nm/OD280 nm UI: unit UV: ultra violet 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vấn đề chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm trong đó có các sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến đã và đang là mối quan tâm của xã hội. Thịt chế biến thƣờng có nguồn gốc từ một loại hay nhiều loại thịt khác nhau. Do sự đa dạng về chất lƣợng, giá cả của các loại thịt đã gây ra vấn đề gian lận trong thƣơng mại (đối với cả thịt tƣơi và thịt chế biến). Đã có rất nhiều sản phẩm thịt trên thị trƣờng ghi thành