Khóa luận Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả năng sinh enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN NGỌC HẢI BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. TS Nguyễn Ngọc Hải, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành quá trình thực tập trong thời gian vừa qua. Phòng Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng. Các bạn lớp CNSH 29 đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua. Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Bùi Thị Phi iv TÓM TẮT BÙI THỊ PHI, Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tháng 9/2007. "PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC" Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi và để chế phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi hơn và có tác dụng tốt hơn trong chăn nuôi, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. Kết quả chúng tôi có được: Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ) đến khả năng sinh enzyme (amylase, protease) của vi khuẩn Bacillus subtilis thì chế độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột) đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn thì ở môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis thì ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ, hoạt độ enzyme của vi khuẩn tốt nhất. Nhiệt độ 4 - 100C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 370C trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm. v ABSTRACT A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase, protease) productivity of Bacillus subtilis isolated strains was carried out and the results had showed: We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis. Bacillus subtilis isolated strains could produce more enzyme (amylase, protease) in oxygen continuous supply conditions at 48 hours incubation. The best result obtained for enzyme (amylase, protease) production with sugar rust + 2% starch culture medium in comparing with the others (sugar rust + 1% starch, sugar rust + 1% starch + 0,5% peptone, TSB + 1% starch) and at pH = 7 for 48 hours culture. Enzyme activity conserved better in 4 – 100C than in 30 – 370C. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iii TÓM TẮT ................................................................................................................ iv ABSTRACT ............................................................................................................... v MỤC LỤC ................................................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... ix DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. x DANH SÁCH SƠ ĐỒ .............................................................................................. xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích đề tài ............................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu đề tài ............................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................... 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ........ 3 2.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 4 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................ 4 2.1.5. Đặc điểm sinh hoá ................................................................................. 5 2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .............. 6 2.1.6.1. Cấu tạo bào tử ................................................................................ 6 2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử ....................................................................... 6 2.1.7. Tính chất đối kháng .............................................................................. 6 2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease ..................................... 7 2.3.1. Enzyme amylase ................................................................................... 7 2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................ 7 2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase .................................................................. 7 2.3.1.3. Đặc tính của amylase ..................................................................... 8 vii 2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật ............................................ 10 2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase ....... 10 2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật ..................................................... 11 2.3.2. Enzyme protease ................................................................................. 11 2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease ................................................ 11 2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật ........................... 12 2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật ............................... 13 2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật ..................................................................................................... 14 2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật .................................................... 14 2.3. Giới thiệu về probiotic................................................................................ 15 2.4.1. Định nghĩa ........................................................................................... 15 2.4.2. Chức năng sinh học ............................................................................. 15 2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng .............................................. 15 2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis ..................................................................................................... 16 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 18 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ....................................................... 18 3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 18 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 18 3.2. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 18 3.2.1. Đối tượng khảo sát .............................................................................. 18 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................... 18 3.2.2.1. Thiết bị ......................................................................................... 18 3.2.2.2. Dụng cụ: ...................................................................................... 18 3.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 19 3.4. Phương pháp thực hiện đề tài ..................................................................... 19 3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ........................................... 19 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn ....................................... 19 viii 3.4.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis........................ 19 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được ............ 20 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 21 3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................... 21 3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................................................. 22 3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis. ...................................................... 23 3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis ............................................................................................................. 25 3.4.3.1. Quy trình thực hiện ...................................................................... 25 3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản .............................. 25 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 26 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 26 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ................ 26 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis .......... 26 4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa ................................................................ 27 4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn. .................. 29 4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................................... 31 4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis .......................................................................................... 33 4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất ......... 34 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 36 5.1. Kết luận ...................................................................................................... 36 5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 36 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 40 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 ................................................................................... 21 Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 ................................................................................... 23 Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 ................................................................................... 24 Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hoá ................................................................ 29 Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2)............................................. 29 Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm ... 31 Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. .............. 32 Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất .................... 33 Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm .................................. 34 x DANH SÁCH HÌNH Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................................... 3 Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis ....................................................... 26 Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................... 27 xi DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ................................................ 20 Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006). .. 21 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống tinh thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có t ính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại, phòng bệnh tiêu chảy cho thú đặc biệt là heo con. Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những enzyme vi sinh vật, hoặc những sản phẩm do quá trình lên men của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh. Từ những thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học”. 2 1.2. Mục đích đề tài Tìm hiểu đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic), với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. 1.3. Yêu cầu đề tài Phân lập được loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, hoặc từ chế phẩm. Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng. Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005). 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis  Đặc điểm phân loại: Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba... 4  Đặc điểm phân bố: Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996). 2.1.3. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000). 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy  Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C  Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.  Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.  Môi trường Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng. Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin. Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt. 5 Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều. 2.1.5. Đặc điểm sinh hoá Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+). Phản ứng sinh hoá Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005). 6 2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1