Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật ở vườn quốc gia cát tiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: PHAN TRUNG HẬU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ PHAN TRUNG HẬU ThS. KIỀU PHƢƠNG NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS.TS Bùi Văn Lê ̣ , người đa ̃tâṇ tình hướng dâñ và taọ moị điền kiêṇ để em thưc̣ hiêṇ khóa luâṇ này. Thạc sĩ Kiều Phương Nam , là người thầy hết lòng tận tụy tuyền đạt những kinh nghiệm quí báo trong suốt quá trình làm đề tài. Em xin cảm ơn thầy rất nhiều! Quý thầy cô bộ môn công nghệ sinh học, cùng các thầy cô trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã chỉ dạy và truyền đạt cho chúng em những kiến thức quý báu suốt 4 năm học qua. Em cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tư trường ĐH Khoa hoc̣ Tư ̣nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đôṇg viên tôi những lúc găp̣ khó khăn trong đề tài. Cảm ơn tất cả các thành viên lớp CNSH 29 và các baṇ thân đa ̃cùng tôi chia sẻ những nỗi buồn vui những năm đaị hoc̣. Và trên hết , con cảm ơn ba má , và các anh chị đa ̃luôn chăm lo , ủng hộ, tin tưởng và khích lệ con những lúc khó khăn nhất để con có thể vững bước trên con đường đã chọn. Tháng 9/2007 Phan Trung Hậu iv TÓM TẮT Đề tài “Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trƣởng thực vật ở vƣờn quốc gia Cát Tiên” được thực hiện tại trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007. Kết quả: - Phân lập và làm thuần được 75 chủng vi sinh vật từ vườn Quốc Gia Cát Tiên. Trong đó có 45 chủng trên môi trường chọn lọc MMS (khoáng MS+1% methanol) và 30 chủng trên môi trường chọn lọc MSo (môi trường MS loại bỏ các thành phần chứa nitrogen). - Sàng lọc qua 2 hệ thống (khả năng tác động lên chồi thuốc lá trong điều kiện in vitro và khả năng kích thích hạt nảy mầm của hạt đậu xanh trong điều kiện in vivo), chúng tôi chọn lọc được 9 chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng trên thực vật bao gồm: 6012a, 6019a, 6019b, 6021a, 6027a, ON16a, ON20a, ON28a và ON29b. Kết quả định danh: Chủng 6012a và 6027a được định danh tới cấp độ giống là vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium. Riêng chủng 6012a có thể là một loài mới. Các chủng 6019a, 6019b, 6021a, ON16a, ON20a, ON28a, ON29b là nấm men và có đặc điểm tương đồng với các giống nấm men sau: - Các chủng 6019b, ON16a, ON20a, ON29b có điểm tương đồng với giống Pichia. - Chủng 6019a có điểm tương đồng với giống Cocidiascusc. - Chủng 6021a có điểm tương đồng với giống Rhodotorula. - Chủng ON28a có điểm tương đồng với giống Endomycopsis. v MỤC LỤC CHƢƠNG..................................................................................... ...............TRANG Trang tưạ ................................................................................................................... i Lời cảm ơn .............................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................... v Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... viii Danh sách các hình ................................................................................................. ix Danh sách các sơ đồ và biểu đồ .............................................................................. xi Danh sách các bảng ................................................................................................ xii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ............................................... Error! Bookmark not defined. 1.1. Đặt vấn đề .......................................................... Error! Bookmark not defined. 1.2. Mục tiêu ............................................................. Error! Bookmark not defined. 1.3. Yêu cầu ............................................................... Error! Bookmark not defined. Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................... Error! Bookmark not defined. 2.1. Vườn Quốc gia Cát Tiên ................................... Error! Bookmark not defined. 2.2. Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật ........... Error! Bookmark not defined. 2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tương tác với thực vật dựa vào bản chất của sự tương tác.................................. .................................................................................... 7 2.2.1.1. Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật............ ...... Error! Bookmark not defined. 2.2.1.2. Vi sinh vật gia tăng dinh dưỡng cho cây ..... Error! Bookmark not defined. 2.2.2. Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trưởng ở thực vật. ..... Error! Bookmark not defined. 2.3. Các phương pháp định danh vi sinh vật ............. Error! Bookmark not defined. 2.3.1. Phương pháp truyền thống .............................. Error! Bookmark not defined. vi 2.3.1. Phương pháp hiện đại ...................................... Error! Bookmark not defined. vii Chƣơng 3: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP ........... Error! Bookmark not defined. 3.1. Thời gian và địa điểm ......................................... Error! Bookmark not defined. 3.2. Vật liệu ............................................................... Error! Bookmark not defined. 3.2.1. Mẫu thí nghiệm ............................................... Error! Bookmark not defined. 3.2.2. Thiết bị dụng cụ .............................................. Error! Bookmark not defined. 3.2.3. Hóa chất .......................................................... Error! Bookmark not defined. 3.2.3.1. Môi trường phân lập và làm thuần vi sinh vật biến dưỡng methyl (MMS)……………….. ............................................. Error! Bookmark not defined. 3.2.3.2. Môi trường chọn lọc vi sinh vật cố định nitơ (MSO) . Error! Bookmark not defined. 3.2.3.3. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS) Error! Bookmark not defined. 3.2.3.4. Các môi trường khác .................................... Error! Bookmark not defined. 3.3. Phương pháp thí nghiệm .................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.1. Phân lập và làm thuần ..................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.1.1. Lấy mẫu và tăng sinh mẫu: .......................... Error! Bookmark not defined. 3.3.1.2. Phân lập chọn lọc ......................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.1.3. Giữ giống ... ………………………………………………………………….Error! Bookmark not defined. 3.3.2. Định tính .......................................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.2.1. Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng kiện in vitro và in vivo ........................................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.2.2. Xử lý thống kê .............................................. Error! Bookmark not defined. 3.3.2.3. Quan sát hình thái ......................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.3. Định danh vi khuẩn ......................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.3.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa .... Error! Bookmark not defined. 3.3.3.2. Đặc điểm sinh lý ........................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.3.3. Đặc điểm sinh hóa ........................................ Error! Bookmark not defined. viii 3.3.3.4. So sánh tính tương đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard ................. Error! Bookmark not defined. 3.3.3.5. Phân tích trình tự rDNA 16S. ....................... Error! Bookmark not defined. 3.3.4. Định danh nấm men ........................................ Error! Bookmark not defined. 3.3.4.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men ... Error! Bookmark not defined. 3.3.4.2. Xác định một số đặc tính sinh hóa của nấm men ....... Error! Bookmark not defined. Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................. Error! Bookmark not defined. 4.1. Kết quả phân lập và làm thuần ........................... Error! Bookmark not defined. 4.2. Kết quả sàng lọc các chủng có khả năng tương tác với thực vật. .............. Error! Bookmark not defined. 4.2.1. Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật của các chủng VSV trong điều kiện in vitro ....................................................... Error! Bookmark not defined. 4.2.2. Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống .... Error! Bookmark not defined. 4.3. Định danh vi sinh vật ......................................... Error! Bookmark not defined. 4.3.1. Kết quả quan sát hình thái ............................... Error! Bookmark not defined. 4.3.2. Định danh vi vi khuẩn.................................................................................... 59 4.3.2.1. Kết quả khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa......................... 59 4.3.2.2. Phân tích trình tự rDNA 16S .......................................................................70 4.3.3. Định danh nấm men .......................................................................................77 4.3.3.1. Quan sát các đặc điểm hình thái nấm men ..................................................77 4.3.3.2. Các đặc điểm sinh lí, sinh hóa .....................................................................80 Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ....................... Error! Bookmark not defined.2 5.1 Kết luận .................................................... Error! Bookmark not defined.2 5.2 Đề nghị ....................................................... Error! Bookmark not defined. ix TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………….. ………….85 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair EDTA Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid MS Murashige và Skoog, 1962 CMS Môi trường bổ sung 2% cao thịt và 2% casein MMS môi trường Methanol Minerol Salts Gram (-) Gram âm Gram (+) Gram dương PPFM Pink-Pigment Facultative Methylotrophic PCR Polymerase chain reaction MSo Môi trường khoáng MS không có nitrogen DNA Deoxyribonucleotide Acid Taq Tag polymerase LDC Lysine decarboxylase PHB Poly-beta-hydroxybutyrate ix DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ở vi khuẩn biến dưỡng methyl; (B) Khuẩn lạc Methylobacterium từ cỏ ba lá trên môi trường phân lập .......................................................................... 6 Hình 2.2: Phổ tương tác cố định đạm trên thực vật ................................................. 10 Hình 2.3: Azospirillum brasilense bề mặt của rễ lúa ............................................... 11 Hình 3.1: Chu trình nhiệt của các phản ứng PCR .................................................... 41 Hình 4.1: Kết quả tương tác của các chủng vi sinh vật lên chồi thuốc lá sau 2 tuần ............................................................................................. 49 Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo ở chồi thuốc lá khi bổ sung chủng 6027a .............................................................................................................. 49 Hình 4.3: Kết quả tương tác của 2 chủng vi sinh vật ON16a (A), ON29b (B) lên chồi thuốc lá ..................................................................................... 52 Hình 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của chúng 6012a so với đối chứng sau 2 ngày. .......................................................................... 55 Hình 4.5: Kết quả khảo sát khả năng kích hạt nảy mầm của chủng ON20a so với đối chứng. .......................................................................................... 57 Hình 4.6: Hình thái tế bào qua kính hiển vi vật kính 100X. ..................................... 60 Hình 4.7: Khảo sát ngưỡng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn 6012a và vi khuẩn 6027a ........................................................................................... 63 Hình 4.8: Kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR của hai chủng vi khuẩn. .................................................................................................................... 66 Hình 4.9: Kết khảo sát khả năng cố định nitơ của hai chủng 6012a và 6027a. ................................................................................................................... 67 Hình 4.10: Kết quả định tính PHB của chủng 6012a dưới kính hiển vi huỳnh quang bươc sóng 460nm. ............................................................................. 68 Hình 4.11: DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn. ..................................................... 71 x Hình 4.12: Sản phẩm PCR với cặp mồi (2F, 2R). ..................................................... 72 Hình 4.13: Sản phẩm PCR với cặp mồi (27F, 1525R).............................................. 73 Hình 4.14: Sản phẩm PCR với cặp mồi (520F, 920R).............................................. 74 Hình 4.15: Mối quan hệ phát sinh loài của chủng 6012a với tất cả các chủng chuẩn của các loài Methylobacterium đã và sẽ công bố trong năm 2007 dựa trên trình tự rDNA 16S nguyên vẹn ................................... 76 xi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm ............................................................................ 24 Biểu đồ 4.1: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MS ................................... 47 Biểu đồ 4.2: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MS .......................... 48 Biểu đồ 4.3: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MSo ..................................................... 51 Biểu đồ 4.4: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MSo .............................................. 51 Đồ thị 4.1: Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610nm và mật độ tế bào .......................................................................................................... 61 Đồ thị 4.2: Đường cong tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn phân lập được ........... 61 Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy ..................... 62 Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy .................................... 62 xii DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR ............................................................................................... 37 Bảng 4.1: Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) ............... 47 Bảng 4.2: Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trên chồi thuốc lá nuôi cấy in vitro trong môi trường MSo .................... 50 Bảng 4.3: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl ................................................................................... 53 Bảng 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường MSo ...................................................... 55 Bảng 4.5: Bảng thống kê các đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật có khả năng tương tác với thực vật ......................................................... 58 Bảng 4.6: Các đặc điểm hình thái cơ bản của 2 chủng vi khuẩn ............................. 60 Bảng 4.7: Đặc điểm biến dưỡng carbon của hai chủng 6012a và 6027a .................. 64 Bảng 4.8: Bảng kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR và hoạt tính Catalase……………………………………………………………………66 Bảng 4.9: Bảng tổng kết các đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn ................................................................................................. 69 Bảng 4.10: Nồng độ và độ tinh sạch DNA bộ gen của chủng phân lập được ghi nhận qua máy đo Nanodrop ........................................................ 71 Bảng 4.11: Hệ số tương đồng di truyến của chủng 6012a với các loài Methylobacterium sp. đã được công bố .................................................................... 75 Bảng 4.11: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men .......................................... 78 Bảng 4.12: Khả năng lên men đường glucose .......................................................... 80 Bảng 4.13: Khả năng đồng hóa nguồn carbon và đồng hóa nitrat ............................ 80 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề Từ xưa đến nay, năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mọi nền nông nghiệp. Do đó đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cũng như tăng cường sức đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá học. Tuy nhiên các biện pháp này còn rất nhiều hạn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hoá đất và ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các biện pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao. Bên cạnh đó, gần đây nhiều công bố khoa học cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật, trong đó các vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen và biến dưỡng methyl đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm. Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật này được biết đến thông qua cơ chế cố định đạm hoặc sự sản sinh các hợp chất sinh học như các phytohormone, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế sự phát triển của mầm bệnh qua đó kích thích sinh trưởng của cây chủ. Chính bởi những ưu điểm này mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đang là một hướng đi đầy tiềm năng. Đặc biệt trong điều kiện nước ta là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học phong phú với các khu bảo tồn thiên nhiên còn hoang dã, thì tiềm năng tìm thấy các chủng vi sinh vật có ích trên là rất lớn. 2 Trên những cơ s