Khóa luận Phát hiện loài fusarium spp. gây bệnh thối xương rồng (cactaceae) bằng phương pháp polymerase chain reaction (pcr)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN LOÀI Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG PHƢƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện : PHẠM THỊ HẰNG Thành phố Hồ Chí Minh - Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện KS. DƢƠNG THÀNH LAM PHẠM THỊ HẰNG TS. LÊ ĐÌNH DÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận đƣợc rất nhiều sự ủng hộ và giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến: Cha Mẹ và những ngƣời thân luôn tạo điều kiện, động viên con trong suốt quá trình con học tập tại trƣờng. Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả Thầy Cô đã tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn và thầy Dƣơng Thành Lam đã hết lòng giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm, các Anh Chị làm việc tại phòng thí nghiệm 105 Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học cùng các Anh Chị làm việc tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Các Bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài tốt nghiệp. Tp. Hồ Chí Minh tháng 9 năm 2007 Phạm Thị Hằng iii TÓM TẮT PHẠM THỊ HẰNG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9-2007 “PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)” tại phòng Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học trƣờng Đại học Nông Lâm và Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng – phòng Công nghệ Sinh học Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm – TP.HCM. Thời gian thực hiện đề tài: 20/3/2007 đến 30/7/2007. Giáo viên hƣờng dẫn: KS. Dƣơng Thành Lam. TS. Lê Đình Đôn.  Nội dung nghiên cứu  Điều tra tình hình bệnh hại xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh.  Thu thập xƣơng rồng bị bệnh từ các vƣờn điều tra. Từ đó phân lập, nhân và thu sinh khối các dòng nấm đã phân lập đƣợc.  Ly trích thu DNA. Thực hiện quy trình phản ứng PCR khuếch đại trình tự nằm trong vùng tef bằng primer ef1 và ef2 của các dòng nấm phân lập đƣợc.  Giải trình tự sản phẩm PCR.  Chủng bệnh lên xƣơng rồng khỏe mạnh.  Kết quả đạt đƣợc  Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra: Bệnh do vi khuẩn: 7,43%. Bệnh do nấm: 18,2%. Bệnh do virus: 0,16%.  Phân lập đƣợc 12 dòng nấm từ các mẫu xƣơng rồng bị bệnh với 2 hình thái có màu khuẩn lạc đặc trƣng: Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn. Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn. iv  Ly trích đƣợc DNA tổng số của 12 dòng nấm phân lập đƣợc. Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 700 bp nằm trong vùng tef của các dòng nấm (dựa vào thang ladder).  Giải trình tự vùng tef của 3 dòng nấm thuộc Fusarium spp. gồm: FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10. Xác định dòng FC07 – 3 và FC07 – 10 là nấm Fusarium solani. Còn dòng FC07 – 7 đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu.  Chủng bệnh nấm trên xƣơng rồng khỏe: 7 dòng nấm có khả năng gây bệnh nặng sau 4 ngày chủng bênh (ở nhiệt độ phòng). v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................. ii TÓM TẮT ................................................................................................................. iii MỤC LỤC ................................................................................................................... v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ ................................................................... x DANH SÁCH ĐỒ THỊ ............................................................................................... x Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích - yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2 1.3 Giới hạn của đề tài ........................................................................................ 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Một số đặc tính để phát triển kiểng xƣơng rồng .......................................... 3 2.2. Phân loại thực vật và giới thiệu về cây xƣơng rồng (Cactaceae) ................ 4 2.2.1. Phân loại thực vật .................................................................................. 4 2.2.2. Giới thiệu về cây xƣơng rồng và các cây cùng họ ................................ 4 2.2.3. Tình hình sản xuất và phát triển xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh và trên thế giới .......................................................................................................... 5 2.2.3.1. Tại Tp. Hồ Chí Minh ..................................................................... 5 2.2.3.2. Trên thế giới .................................................................................. 6 2.2.4. Đặc tính thực vật và điều kiện sinh thái của xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) ................................................................................................... 6 2.2.4.1. Đặc tính thực vật............................................................................ 6 2.4.2.2. Điều kiện sinh thái .................................................................... 10 vi 2.2.5. Bệnh hại trên cây xƣơng rồng ............................................................. 11 2.2.5.1. Bệnh thối gốc xƣơng rồng ........................................................... 11 2.2.5.2. Bệnh đốm than ............................................................................. 11 2.2.5.3. Tuyến trùng hại xƣơng rồng ........................................................ 12 2.2.5.4. Rệp sáp hại xƣơng rồng ............................................................... 12 2.3. Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và khả năng gây bệnh của nấm Fusarium .................................................................. 12 2.3.1. Sự phân loại ........................................................................................ 12 2.3.2. Sự phân bố .......................................................................................... 14 2.3.3. Phạm vi kí chủ .................................................................................... 14 2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium .............................. 14 2.4. Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp. gây ra và biện pháp phòng trừ 14 2.4.1. Khả năng gây hại ................................................................................ 14 2.4.2. Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp. ............... 16 2.4.2.1. Sử dụng cây giống kháng bệnh ................................................... 16 2.4.2.2. Biện pháp canh tác ....................................................................... 16 2.4.2.3. Biện pháp hóa học ....................................................................... 17 2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium ............................ 17 2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm ............................................ 18 2.6.1. Khái niệm ............................................................................................ 18 2.6.2. Nguyên tắc .......................................................................................... 19 2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR ............................. 20 2.6.4. Ứng dụng của PCR ............................................................................. 22 2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing ....................................... 22 2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. .. 22 2.8.1. Trên thế giới ........................................................................................ 22 2.8.2. Tại Việt Nam ....................................................................................... 25 2.9. Danh mục một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt nam ...................... 26 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 27 vii 3.1. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 27 3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu ........................................................ 27 3.1.2. Vật liệu ................................................................................................ 27 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 29 3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xƣơng rồng tại TP. Hồ Chí Minh...... ... 29 3.2.2. Phân lập mẫu nấm ............................................................................... 29 3.2.3. Tăng sinh khối nấm trên môi trƣờng nhân sinh khối .......................... 31 3.2.4. Ly trích DNA tổng số của nấm ........................................................... 32 Quy trình này đƣợc thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor. ............... 32 3.2.5. Điện di xem DNA tổng số .................................................................. 32 3.2.6. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm Fusarium spp. .................................................................................................... 33 3.2.7. Đọc trình tự sản phẩm PCR ................................................................ 35 3.2.8. Chủng nấm lên cây xƣơng rồng .......................................................... 36 3.2.8.1. Tiến hành chủng bệnh trên xƣơng rồng....................................... 36 3.2.8.2. Đánh giá kết quả .......................................................................... 36 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 37 4.1. Tình hình bệnh hại xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh ................................ 37 4.2. Các triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng ....................................................... 37 4.2.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007). ........................................................... 39 4.3. Phân lập mẫu nấm ...................................................................................... 40 4.4. Kết quả ly trích thu DNA tổng số từ các loài nấm Fusarium spp. ............. 41 4.5. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng tef .............................................. 43 4.6. Kết quả giải trình tự vùng tef ..................................................................... 43 4.7. Chủng bệnh trên xƣơng rồng ...................................................................... 50 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 52 5.1. Kết luận ...................................................................................................... 52 5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 53 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 54 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 58 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR :Polymerase chain reaction. DNA :Deoxyrybonucleotide acid. TE :Tris EDTA. TAE :Tris Acetate EDTA. dNTP :Deoxynucleotide triphosphate. Taq :Thermus aquaticus. UV :Ulta violet. PGA :Potato glucose agar. WA :Water agar. EtBr :Ethidium bromide. l :micro lít. g :micro gam. M :micro gam/ lít. mM :mili gam/ lít. ctv :cộng tác viên. ng :nano gam. bp :base pair. rDNA : ribosomal DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism. Tm : Melting Tempereture. TEF : Translation elongation factor. ITS : Internal Transcribed Spacer. ix NCBI : National Center for Biotechnology Informatic. DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp. ................................. 13 Hình 2.2. Vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM-ID ........................................ 17 Hình 4.1. Xƣơng rồng với triệu chứng thối gốc ................................ 38 Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc ......... 39 Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân ............................... 39 Hình 4.4. Xƣơng rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài .................................... 39 Hình 4.5. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bệnh trên môi trƣờng PGA ......................................................... 42 Hình 4.6. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của nấm .......................... 43 Hình 4.7. Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ef1 và ef2. ................................................ 44 Hình 4.8. Xƣơng rồng khỏe mạnh trƣớc khi chủng bệnh .................. 51 Hình 4.9. Xƣơng rồng với triệu chứng thối sau khi chủng ................ 51 Hình 4.10. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bị bệnh sau khi chủng nấm 4 ngày trên môi trƣờng PGA. .......... 52 x DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ BẢNG TRANG Bảng 2.1. Một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996). .................................. 26 Bảng3.1. Primer dùng trong phản ứng PCR .................................... 33 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR và lƣợng cần dùng đủ cho một phản ứng ........................................ 34 Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra ................................. 40 Bảng 4.2. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng giữa dòng FC07 – 3, FC07 – 7 và FC07-10. ................... 46 Bảng 4.3. So sánh phần trăm độ tƣơng đồng (%) giữa 3 dòng FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 với các dòng trên genbank........ 49 DANH SÁCH ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra ................................. 40 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, do nhu cầu đời sống của con ngƣời đƣợc nâng cao nên vấn đề thƣ giãn tinh thần ngày càng đƣợc coi trọng. Hiện nay vấn đề chơi cây cảnh trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh (Tp: thành phố) ngày càng phát triển trong đó có xƣơng rồng. Xƣơng rồng đang dần đƣợc khẳng định trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh vì chúng tƣơng đối dễ trồng, giá cả phải chăng, ai cũng có thể chơi và chăm sóc. Xƣơng rồng dù sống trên sa mạc khô cằn vẫn nở hoa sặc sở, thể hiện một sức sống mãnh liệt. Do nhu cầu của ngƣời sử dụng thích những loại xƣơng rồng lạ nên nhà vƣờn thƣờng lai tạo ra các loại cây ghép với sự đa dạng về chủng loại từ đó làm cho bệnh hại xƣơng rồng cũng phát triển theo. Xƣơng rồng cũng bị rất nhiều mầm bệnh tấn công và hậu quả của nó là làm cho nhiều loại quí hiếm của ngƣời sƣu tầm giống bị hƣ hại dẫn đến giảm phẩm chất, bệnh nặng và có thể chết hàng loạt gây thiệt hại cho nhà vƣờn và ngƣời sử dụng. Các bệnh thƣờng gặp trên xƣơng rồng: bệnh thối gốc, bệnh đốm than… và một trong những bệnh phổ biến nhất là bệnh thối do nấm Fusarium spp., bệnh này gây nguy hiểm cho tất cả các loại xƣơng rồng. Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây bệnh để từ đó có những định hƣớng đúng đắn trong việc phòng trừ bệnh, nhằm làm giảm thiệt hại và mang lại hiệu quả cho ngƣời sản xuất. Đƣợc sự chấp thuận của bộ Môn Công nghệ Sinh học Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dƣới sự hƣớng dẫn của KS. Dƣơng Thành Lam và TS. Lê Đình Đôn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện nấm Fusarium spp. gây bệnh thối xƣơng rồng (Cactaceae) bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)”. 2 1.2. Mục đích - yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định tên loài Fusarium spp. gây bệnh thối xƣơng rồng nhằm tìm ra quy trình phòng trừ hữu hiệu cho xƣơng rồng. 1.2.2. Yêu cầu  Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh.  Thu thập và phân lập mẫu nấm trên xƣơng rồng bệnh. Nhân sinh khối các dòng nấm Fusarium spp.  Ly trích DNA các dòng nấm phân lập đƣợc. Thiết lập quy trình phản ứng PCR để khảo sát các yếu tố nhƣ chu kì nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu kì thích hợp.  Giải trình tự sản phẩm PCR.  Chủng bệnh trên xƣơng rồng khỏe. 1.3 Giới hạn của đề tài  Đề tài đƣợc thực hiện từ 20/03/2007 đến 30/07/2007.  Chỉ thực hiện đƣợc trên một số mẫu. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Một số đặc tính để phát triển xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) Trƣớc đây không chỉ ở nƣớc ta mà nhiều nƣớc trên thế giới cũng vậy, số ngƣời thích chơi kiểng xƣơng rồng rất ít. Ngƣời nào thích “sƣu tập” thì số lƣợng cũng không nhiều. Nhƣng, càng về sau, số nghệ nhân đến với kiểng xƣơng rồng càng ngày càng nhiều, khi họ nhận ra một điều loại kiểng trụi lá này đƣợc các nhà thực vật học không ngừng lai tạo thêm nhiều cây có hình dáng lạ, và màu sắc cũng khác lạ. Xƣơng rồng có đủ loại: cây cao có mà cây thấp cũng có, cây to cây nhỏ cũng nhiều. Theo thói quen, hễ nói đến cây kiểng, ai cũng nghĩ là trồng ở trong vƣờn, ngoài sân, trƣớc hàng ba, lan can… nơi có nhiều nắng gió thông thoáng, chứ không ai nghĩ kiểng lại đem chƣng bày trong nhà, nơi thiếu ánh nắng và không khí lúc nào cũng hầm hập. Với xƣơng rồng là loại cây kì diệu, có thể sống tƣơi tốt trong nhà một vài tuần, thậm chí cả tháng, trong điều kiện thiếu hẳn ánh nắng, thiếu bón tƣơi… chính sự kì diệu này đã đƣa kiểng xƣơng rồng đến với mọi ngƣời, mọi nhà, trong đó có đông đủ cƣ dân thành thị. Đƣợc biết, tại nhiều nƣớc Âu Mỹ, mãi đến những năm đầu thế kỷ XX, ngƣời ta mới khám phá ra đƣợc điều này. Bởi vì trong giai đoạn này các thành phố của họ mật độ thị dân tăng cao đột ngột. Từ đó, đƣờng sá đƣợc mở rộng thêm, nhà cửa đƣợc cao tầng hơn, đất thổ cƣ trong thành phố còn lại bao nhiêu điều đƣợc trƣng dụng vào việc cất thêm nhà cửa…. Nhƣ vậy, không ai còn một khoảng đất thừa nào để trồng cây cảnh nhƣ trƣớc đây nữa! 4 Vì vậy, muốn trực tiếp đƣợc sống gần gũi với thiên nhiên, muốn có cây cảnh để giải trí, giảm stress, các thị dân mới nghĩ đến… kiểng xƣơng rồng, và đổ xô tìm mua về trồng. Ai cũng biết, chỉ có xƣơng rồng mới có khả năng sống lâu đƣợc trong nhà, lúc nào khí hậu cũng nóng và khô. Mặt khác, kiểng xƣơng rồng dùng chƣng trong nhà, thấp, choáng mặt bằng không nhiều nên dùng làm vật trang trí rất thích hợp và đẹp. Xƣơng rồng thƣờng đƣợc trồng trong loại chậu kiểng bằng gốm sứ với nhiều kiểu dáng khác nhau. So với nhiều giố