Khóa luận Sử dụng chỉ thị phân tử microsatellite đánh giá đa dạng di truyền các dõng keo lá tràm (acacia auriculiformis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên:Trần Thị Thanh Hƣơng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. VƢƠNG ĐÌNH TUẤN TRẦN THỊ THANH HƢƠNG Niên khóa: 2003-2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 1 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn Ba Má cùng các anh chị trong gia đình đã nuôi dạy con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài.  Chân thành cảm ơn! Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam bộ Trung Tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh. Đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến độ.  Chân thành cảm ơn! Tất cả các Thầy Cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cho lớp chúng tôi trong thời gian học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Chân thành cảm ơn! TS.Vƣơng Đình Tuấn TS. Nguyễn Quốc Bình Đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài.  Chân thành cảm ơn! Chị Ngô Huỳnh Phƣơng Thảo và tất cả các anh, chị và các bạn lớp Công nghệ sinh học 29, đã không ngừng động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiên đề tài. Xin chân thành tri ân! Sv: TRẦN THỊ THANH HƢƠNG 2 TÓM TẮT TRẦN THỊ THANH HƢƠNG, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)”. Hƣớng dẫn khoa học: TS.Vƣơng Đình Tuấn  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 3/2007 đến 8/2007.  Địa điểm nghiên cứu Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ . Trung tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh.  Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Từ đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao.  Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam.  Phƣơng pháp nghiên cứu - Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu lá của 100dòng Keo lá tràm thu đƣợc với 9cặp mồi.  Kết quả - Bƣớc đầu thanh lọc đƣợc một số cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền. Và có sự khác nhau về trọng lƣợng các bands của các cá thể phân tích và có sự biến động di truyền giữa các cá thể.  Kết luận 3 - Thí nghiệm đã thanh lọc đƣợc một số cặp mồi (Am 341, Am 326 và Am 770) có thể cho hiệu quả phân tích đa dạng di truyền Keo lá tràm khá tốt. 4 MỤC LỤC ĐỀ MỤC ...................................................................................................... TRANG TRANG TỰA ........................................................................................................... ii LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................... iv MỤC LỤC ................................................................................................................ v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ................................................................. x Phần 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Yêu cầu và mục đích nghiên cứu của đề tài ....................................................... 2 1.4 Giới hạn của đề tài ............................................................................................. 2 Phần 2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 4 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học ........................................................................... 4 2.1.1 Định nghĩa ....................................................................................................... 4 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học ......................................................................... 4 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................. 4 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái ............................................................................ 4 2.1.3.2 Đa dạng loài ................................................................................................. 5 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền .................................................................................... 6 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền ........................ 7 2.2.1 Phân loại .......................................................................................................... 7 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ..................................... 8 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) ..................................... 9 2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) ........................ 10 2.2.5 SSR (Microsatellite) ...................................................................................... 10 5 2.3 Kỹ thuật Microsatellite ..................................................................................... 11 2.3.1 Khái niệm về Microsatellite .......................................................................... 11 2.3.2 Tính chất ........................................................................................................ 12 2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite ......................................................... 13 2.3.4 Giới hạn của Microsatellite ........................................................................... 14 2.3.5 Các loại Microsatellite .................................................................................. 15 2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite ........................................... 15 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite .............................................................. 15 2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite ........................................................................... 17 2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite ................................................. 18 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai ......................................................................................... 18 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 19 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................. 19 2.4.1 Khái niệm ...................................................................................................... 19 2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR ............................. 20 2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR.......................................................................... 23 2.4.5 Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................ 23 2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật ...................................................................... 23 2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......................................... 25 2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di ...................................... 26 2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) .................................. 28 2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) .......................................................................... 28 2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo .......................................................... 28 2.6.1.2 Công dụng của các loài Keo (Acacia) ........................................................ 30 2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) ........ 32 2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái ............................................................ 33 2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng ............................................................ 35 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................... 36 6 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 36 3.1.1 Thời gian thực hiện ....................................................................................... 36 3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 36 3.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 36 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................. 36 3.4 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 37 3.5 Ly trích DNA ................................................................................................... 37 3.5.1 Hóa chất ....................................................................................................... 37 3.5.2 Quy trình ly trích DNA ................................................................................. 38 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích ................................................................. 40 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR ................................................................................ 40 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR .................................................................................. 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 44 4.1 Quá trình ly trích ............................................................................................. 44 4.2 Phản ứng PCR .................................................................................................. 44 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 48 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 48 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 50 PHỤ LỤC 7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µg: microgram  µM: micromol/lite  Al: Allele  bp: base pair  M:mét  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxynucleotide triphosphate  EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid  EtBt: Ethidium bromide  Kb: kilobases  mM: milimolar (milimol/lite).  PCR: Polymerase chain reaction  RNA: Ribonucleic acid  RNase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của Taq  UV: Ultra Violet 8 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ..................................................... 16 Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ................................................. 16 Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR ................................................... 20 Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia) .......................................................... 29 Hình2.5:Hình thái một số loài Keo ........................................................................ 30 Hình 2.6. Keo lá tràm ............................................................................................. 33 9 DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) ......... 8 Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose ..................................... 27 Bảng 2.3: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide ........................ 27 Bảng 2.4:Các ancaloit trong các loài Keo (Alexander Shulgin. TiHKAL) ............ 32 Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA .............................. 38 Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ........................................................ 41 Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng .......................................................... 41 Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA ................................................................. 39 10 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay cùng với sự phát triển của đời sống, kinh tế, xã hội, nhiều sản phẩm làm từ các chất liệu nhƣ nhựa, nhôm, hợp kim,…,đã ra đời với nhiều công dụng tiện lợi phục vụ cho đời sống tất bật của xã hội loài ngƣời trong giai đoạn phát triển vũ bão. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn không thể nào thay thế đƣợc hoàn toàn sự hiện diện của các sản phẩm đƣợc làm từ gỗ nhƣ: bàn ghế, cửa, kệ, tủ, hàng thủ công mỹ nghệ, tập sách vở…trong các gia đình, công sở, nhà hàng, khách sạn, phòng triển lãm, khu trƣng bày, trƣờng học,…Do các sản phẩm làm từ gỗ mang lại sang trọng, ấm cúng, gần gũi với thiên nhiên cho không gian sử dụng, và chúng còn có thể tái chế. Vậy mà thực tế cho thấy nguồn nguyên liệu gỗ ngày càng suy kiệt, giảm chất lƣợng do sự khai thác bừa bãi, nạn phá rừng của con ngƣời, thiên tai lũ lụt, hạn hán, cháy rừng, sự ô nhiễm môi trƣờng... Keo lá tràm hay còn gọi Keo bông vàng, là loại cây mọc nhanh có xuất xứ từ Australia, Papua, New Guinea và Indonesia,…(Turnbull,1986). Đƣợc du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60 của thế kỉ XX, với mục đích chủ yếu là cung cấp nguồn nguyên liệu cho sản xuất giấy, làm đồ trang trí nội thất, làm than củi,... ( Tại Việt Nam hiện nay, Keo lá tràm đƣợc trồng phổ biến ở nhiều địa phƣơng, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Trung và vùng Đông Nam Bộ. Keo lá tràm đóng góp một cách có ý nghĩa trong ngành công nghiệp sản xuất giấy, nghề chế tác hàng thủ công mỹ nghệ và cũng nhƣ đời sống của nông dân trồng rừng (Bùi Việt Hải,1998). Vì vậy việc chọn và tạo giống Keo lá tràm chất lƣợng cao với năng suất cao, chống chịu sâu bệnh là một nhu cầu hết sức cấp thiết đặt ra cho ngành lâm nghiệp. Việc nghiên cứu chọn giống Keo cũng đã đƣợc triển khai từ hàng chục năm nay ở Viện Khoa học lâm nghiệp nhƣng biện pháp chủ yếu là nhập hạt giống chất lƣợng cao, khảo nghiệm và chọn giống theo phƣơng pháp cổ điển của các dòng cây trội. Việc nghiên cứu chọn giống Keo sử dụng chỉ thị phân tử 11 hoặc trên các cơ sở kỹ thuật cao hầu nhƣ chƣa có nhiều. Các phƣơng pháp chọn giống cổ điển tuy đã góp phần hình thành nên những giống vật nuôi đa dạng, nhƣng do chỉ tiêu chọn thuộc về hình thái, chủ yếu về kiểu hình và chỉ tiêu sinh hóa thƣờng không ổn định và chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi môi trƣờng. Sử dụng chỉ thị phân tử (DNA marker) để chọn giống sẽ bỏ qua các biến động không di truyền đồng thời theo dõi đƣợc các biến động di truyền không thể hiện ra kiểu hình. Hiểu biết về cấu trúc di truyền phân tử sẽ giúp chúng ta có cơ sở vững chắc trong việc sử dụng nguồn tài nguyên thực vật một cách có hiệu quả hơn để cải thiện giống cây trồng, phục vụ tốt hơn công tác quản lí và bảo tồn đa dạng sinh học, rút ngắn thời gian của quá trình chọn, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng. Nhằm góp phần đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) ở Việt Nam, đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền của các dòng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis)” đƣợc thực hiện do sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học và sự hƣớng dẫn chính của TS. Vƣơng Đình Tuấn. 1.2 Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Tƣd đó xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao. 1.3 Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dòng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam. 1.4 Giới hạn của đề tài Do quỹ thời gian và kinh phí còn hạn chế nên chúng tôi mới chỉ dừng lại ở việc thanh lọc các cặp mồi SSR để tìm ra những cặp mồi thích hợp cho những nghiên cứu tiếp theo trong việc hoàn thiện đánh giá đa dạng di truyền Keo lá tràm. Và đề tài chỉ thực hiện trên một số mẫu nghiên cứu thu thập đƣợc ở Trạm thực 12 nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Bình Dƣơng) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam. 13 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học 2.1.1 Định nghĩa Thuật ngữ "đa dạng sinh học" lần đầu tiên đƣợc Norse và McManus (1980) định nghĩa, bao hàm hai khái niệm có liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính đa dạng về mặt di truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lƣợng các loài trong một quần xã sinh vật). Đa dạng sinh học (Biodiversity) là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002). Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất định nghĩa: “ Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”. 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học Sự đa dạng của sinh vật trong thiên nhiên chứa dựng vẻ đẹp vô tận, đó chính là nguồn cảm hứng sáng tạo và cũng là nguồn kiến thức phong phú của nhân loại. Sự đa dạng sinh học cung cấp cho con ngƣời nguồn thức ăn phong phú và đa dạng chủng loại; cung cấp nguồn hàng hoá và nguyên vật liệu phong phú và cần thiết cho nông nghiệp, cho dƣợc học, cho khoa học công nghệ. Đa dạng sinh học là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp. Ngoài ra đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng từ đó tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái Đây là sự đa dạng bao trùm và cao nhất của đa dạng sinh học. 14 Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi trƣờng. Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh. Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau giữa các quần xã sinh vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình) (OTA, 1987; FAO, 1