Khóa luận Sử dụng kỹ thuật lai Southern trong phân tích cây chuyển gen

MỞ ĐẦU Hiện nay, trên thế giới việc chuyển gen vào thực vật đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong cải tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50 loại gen được chuyển vào thực vật và có khoảng 400 loại cây trồng chuyển gen đã được kiểm tra ngoài đồng ruộng. Nhiều sản phẩm chuyển gen đang được tiêu thụ trên thị trường như bông, ngô, đậu tương có khả năng kháng sâu, kháng chất diệt cỏ, cải dầu có thành phần dầu thay đổi, cà chua chín chậm v.v… Ở nước ta, một số phòng thí nghiệm đã và đang áp dụng kỹ thuật chuyển gen để cải tạo nhiều loại giống cây trồng khác nhau. Trong đó, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học là một trong những đơn vị đang tiến hành theo hướng nghiên cứu này. Cho đến nay, phòng đã tạo ra được một số dòng cây chuyển gen và đang đưa vào phân tích. Bên cạnh những đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển như chịu hạn, mặn, kháng sâu, kháng bệnh, những phân tích phân tử cũng được tiến hành. Cho đến nay, kết quả phân tích phân tử cây chuyển gen chỉ dừng lại bằng sử dụng kỹ thuật PCR. Lai Southern là kỹ thuật quan trọng, có giá trị khẳng định sự có mặt của gen chuyển. Ngoài ra, với kỹ thuật này mới có thể đánh giá chính xác số điểm gắn của gen chuyển, thông qua đó có thể phân tích được sự liên quan giữa mức biểu hiện và kiểu gắn của gen chuyển. Nhằm đưa quy trình lai Southern vào mục đích đánh giá cây chuyển gen, chúng tôi sử dụng các dòng bông kháng sâu làm nguyên liệu nghiên cứu và áp dụng hệ thống phi phóng xạ DIG để kiểm tra phân tích gen CryIA. Bản khoá luận này báo cáo lại những kết quả nghiên cứu bước đầu về sử dụng kỹ thuật lai Southern trong phân tích cây chuyển gen. Đây là tiền đề cho các phân tích phân tử tiếp theo đối với các cây chuyển gen khác đã và đang được tạo ra. Ch­¬ng 1: Tæng quan tµi liÖu 1.1. ChuyÓn gen ë thùc vËt 1.1.1. ChuyÓn gen ë thùc vËt vµ nh÷ng lîi Ých ®èi víi c¶i t¹o gièng c©y trång Vµo nh÷ng n¨m ®Çu cña thËp kØ 80, c¸c nhµ khoa häc kh¸m ph¸ ra viÖc chuyÓn gen hay cßn gäi lµ biÕn n¹p gen vµo thùc vËt ®Ó t¹o ra ®Æc tÝnh di truyÒn míi nh­ kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh hay vËt g©y h¹i. NhiÒu kü thuËt chuyÓn gen ra ®êi, ®­îc hoµn thiÖn vµ ¸p dông réng r·i nh­: b¾n gen trùc tiÕp, th«ng qua Agrobacterium, nhê vµo xung ®iÖn hoÆc ho¸ häc. Trong ®ã, hai ph­¬ng ph¸p b¾n gen trùc tiÕp th«ng qua Agrobacterium tá ra h÷u hiÖu h¬n c¶. Vµo n¨m 1983, c©y biÕn n¹p gen ®Çu tiªn ra ®êi ®ã lµ c©y thuèc l¸ kh¸ng kh¸ng sinh. N¨m 1985, mét sè c©y chuyÓn gen kh¸ng s©u, bÖnh virus vµ bÖnh nÊm lÇn lÇu tiªn ®­îc ®­a ra thö nghiÖm ngoµi ®ång ruéng. §Õn nay, sù biÕn n¹p gen vµo c©y trång kh«ng cßn lµ vÊn ®Ò ph¶i tranh c·i n÷a mµ ®· trë thµnh kü thuËt th«ng dông trong t¹o gièng c©y trång. §· cã h¬n 50 lo¹i gen ®­îc chuyÓn vµo c©y trång vµ Ýt nhÊt kho¶ng 400 lo¹i ®· ®­îc kiÓm tra ngoµi ®ång ruéng. §èi víi c¸c loµi c©y rau, chuyÓn gen ®· thµnh c«ng nh­ ë cµ chua, cµ rèt, khoai t©y, rau diÕp, cÇn t©y, sóp l¬, d­a chuét, d©u t©y, c¶i xanh, c¶i b¾p, m¨ng t©y,… ë c¸c c©y trång ngò cèc nh­ lóa n­íc, lóa m¹ch, lóa mú, ng« vµ c¶ nh÷ng c©y c«ng nghiÖp nh­ c©y b«ng viÖc nghiªn cøu chuyÓn gen còng ®· thu ®­îc nhiÒu kÕt qu¶ kh¶ quan [1]. Nh÷ng c©y trång ®­îc chuyÓn gen vÉn gièng c©y trång truyÒn thèng nh­ng chóng cã thªm mét sè ®Æc ®iÓm ®­îc c¶i thiÖn. V× vËy øng dông kü thuËt chuyÓn gen ë thùc vËt nh»m c¶i t¹o gièng c©y trång ®· ®em l¹i nhiÒu lîi Ých râ rÖt trong ph¸t triÓn s¶n xuÊt n«ng nghiÖp vµ phôc vô ®êi sèng con ng­êi. Cã thÓ ®iÓm nh÷ng lîi Ých ®ã nh­: T¨ng s¶n l­îng. Gi¶m chi phÝ s¶n xuÊt. T¨ng lîi nhuËn n«ng nghiÖp. C¶i thiÖn m«i tr­êng. Ngµy nay, c¸c nhµ khoa häc ®ang h­íng tíi t¹o nh÷ng c©y chuyÓn gen thÕ hÖ thø 2 cã ®Æc ®iÓm t¨ng gi¸ trÞ dinh d­ìng hoÆc cã nh÷ng tÝnh tr¹ng thÝch hîp cho c«ng nghiÖp chÕ biÕn. Nh÷ng lîi Ých nµy h­íng trùc tiÕp h¬n vµo ng­êi tiªu dïng nh­: Lóa g¹o giµu vitamin A vµ s¾t. Khoai t©y t¨ng hµm l­îng tinh bét. Vacxin ¨n ®­îc ë ng« vµ khoai t©y. Nh÷ng gièng ng« trång ®­îc trong ®iÒu kiÖn nghÌo dinh d­ìng. DÇu ¨n cã lîi cho søc khoÎ tõ ®Ëu nµnh vµ c¶i dÇu [7]. 1.1.2. Nh÷ng thµnh tùu chuyÓn gen ë thùc vËt trªn thÕ giíi vµ trong n­íc Trªn thÕ giíi, diÖn tÝch trång c©y chuyÓn gen t¨ng tõ 1,7 triÖu ha n¨m 1996 lªn 11 triÖu ha n¨m 1997, 27,8 triÖu ha n¨m 1998, 39,9 triÖu ha n¨m 1999 vµ tíi h¬n 44 triÖu ha n¨m 2000. C¸c quèc gia trång c©y chuyÓn gen gåm cã Achentina, óc, Bungary, Canada, Trung Quèc, Ph¸p, §øc, Mexico, Rumani, T©y Ban Nha, Nam Phi, urugoay vµ Mü. HiÖn nay, nh÷ng s¶n phÈm l­¬ng thùc, thùc phÈm do c«ng nghÖ sinh häc t¹o ra ®· cã mÆt trªn thÞ tr­êng. C¸c thµnh tùu cña biÕn n¹p gen ë thùc vËt tËp trung vµo mét sè h­íng nh­: - ChÞu chÊt diÖt cá Ng­êi ta dïng gen tæng hîp EPSP chuyÓn vµo c©y trång ®Ó chÞu ®­îc Glyphosphat. NhiÒu loµi thùc vËt ®· biÕn n¹p vµ ®ang ®­îc thö nghiÖm nh­ cñ c¶i ®­êng, ®Ëu t­¬ng, nho. c¶i h¹t dÇu, b«ng, cµ chua vµ thuèc l¸. C©y ®Ëu t­¬ng chuyÓn gen chÞu thuèc diÖt cá khèng chÕ cá d¹i tèt h¬n, gãp phÇn n©ng cao hiÖu qu¶ cña c¸c trang tr¹i nhê tèi ­u ho¸ n¨ng suÊt vµ sö dông hiÖu qu¶ ®Êt trång trät, tiÕt kiÖm thêi gian cho n«ng d©n. Gièng míi nµy hoµn toµn gièng c¸c gièng ®Ëu t­¬ng kh¸c vÒ dinh d­ìng, cÊu t¹o vµ ph­¬ng thøc chÕ biÕn thµnh thùc phÈm vµ thøc ¨n gia sóc. §­îc trång nhiÒu ë Achentina, óc, Braxin, Canada, EU, NhËt b¶n, Hµn Quèc, Mexico, Nga, Thôy §iÓn, Mü vµ uruguay. C¶i dÇu chÞu thuèc diÖt cá ®­îc trång t¹i óc, Canada vµ Mü. - Kh¸ng bÖnh virus Ng­êi ta ®ang nghiªn cøu c¸c gen kh¸ng bÖnh virus ë thùc vËt. Ngoµi ra ®ang nghiªn cøu kh¶ n¨ng kh¸ng virus b»ng biÕn n¹p gen tõ ®éng vËt. §u ®ñ ®­îc chuyÓn gen cña virus m· ho¸ cho protein vá cña virus ®èm vßng. Protein nµy t¹o cho c©y kh¶ n¨ng tù b¶o vÖ chèng l¹i bÖnh ®èm vßng. Mét gen tõ nguån bÖnh ®· ®­îc sö dông ®Ó kh¸ng l¹i chÝnh nã. C©y khoai t©y ®· ®­îc chuyÓn gen gióp kh¸ng virus g©y xo¨n l¸, c©y bÝ chuyÓn gen gióp kh¸ng virus g©y bÖnh. - Kh¸ng c¸c loµi g©y h¹i ChuyÓn gen ®éc tè tõ Bacillus thuringiensis (Bt) ®Ó t¹o gièng chÞu c«n trïng cã h¹i. C©y b«ng chuyÓn gen Bt kh¸ng s©u ®ôc qu¶ vµ ¨n l¸, ®­îc trång phæ biÕn ë nhiÒu n­íc nh­ Trung quèc, Nam phi, Achentina,... C¸c c©y b«ng, lóa mang gen chuyÓn nµy cã kh¶ n¨ng chèng chÞu s©u ®ôc th©n rÊt tèt. - Chèng chÞu c¸c bÖnh nÊm Ng­êi ta ®ang ph©n lËp gen 1,3-glucanase (m· hãa enzym ph©n hñy thµnh tÕ bµo cña c¸c mÇm bÖnh nÊm) tõ thùc vËt kh¸ng bÖnh ®Ó chuyÓn vµo c¸c loµi c©y mÉn c¶m. - Thay ®æi thµnh c¸c axit bÐo Ng­êi ta lµm t¨ng hµm l­îng axit bÐo ®¬n kh«ng no vµ c¸c thµnh phÇn dÇu thùc vËt. C©y ®Ëu t­¬ng chuyÓn gen axit oleic cã hµm l­îng axit oleic cao, mét axit bÐo cã mét liªn kÕt kh«ng no. Theo c¸c nhµ dinh d­ìng th× chÊt bÐo kh«ng no ®­îc xem lµ tèt h¬n so víi chÊt bÐo no, ®­îc t×m thÊy ë thÞt bß, lîn, phomat vµ mét sè thøc ¨n th­êng ngµy kh¸c. C¶i dÇu chuyÓn gen cã hµm l­îng Laurate cao, ®­îc dïng trong c«ng nghiÖp thùc phÈm ®Ó lµm líp phñ ngoµi kÑo chocolate, b¸nh ngät, líp kem, b¬, ®­îc trång ë Canada vµ Mü. C¶i dÇu cã hµm l­îng axit oleic cao ®­îc trång ë Canada. - Lµm chËm chÝn qu¶ ë cµ chua C©y cµ chua mang mét gen chuyÓn lµm chËm qu¸ tr×nh lµm mÒm qu¶ tù nhiªn khi qu¶ chÝn. §©y lµ lo¹i thùc phÈm chuyÓn gen ®Çu tiª n ®­îc s¶n xuÊt ë c¸c n­íc ph¸t triÓn. Gièng cµ chua nµy cã thêi gian l­u trªn gi¸ b¸n hµng dµi h¬n. Ngoµi ra gièng chuyÓn gen cã c¸c ®Æc tÝnh nh­: - §iÒu chØnh sinh tæng hîp tinh bét ®Ó lµm chñ møc tinh bét trong s¶n phÈm. - C¶i thiÖn chÊt l­îng ®¹m tÝch lòy trong h¹t. - T¨ng hµm l­îng vitamin A trong h¹t g¹o, [7]. ë n­íc ta, mét sè phßng thÝ nghiÖm lín ®· vµ ®ang ®i s©u vµo c«ng t¸c c¶i thiÖn gièng c©y trång b»ng kü thuËt chuyÓn gen. T¹i phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, c¸c b­íc c¬ b¶n trong giai ®o¹n chuÈn bÞ ®· ®­îc thùc hiÖn. §ã lµ: Thu thËp vµ cÊt gi÷ c¸c nguån gen cã gi¸ trÞ nh­ gen CryIA(b), CryIA(c), gen øc chÕ tryspin ®Ó trõ s©u, gen Xa21 chèng b¹c l¸ vi khuÈn, gen chÞu l¹nh, gen protein giµu tryptopha. ThiÕt kÕ c¸c vector mang gen chuyÓn vµ thö nghiÖm thµnh c«ng c¸c kü thuËt chuyÓn gen: gi¸n tiÕp th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens, trùc tiÕp b»ng sóng b¾n gen. §Õn nay, nhiÒu dßng lóa chuyÓn gen Xa21, CryIA(c), ®u ®ñ chuyÓn gen chÝn chËm vµ kh¸ng virus ®èm vßng ®· ®­îc t¹o ra. C¸c dßng c©y chuyÓn gen nµy sÏ ®­îc ®­a vµo ph©n tÝch ph©n tö ChuÈn bÞ thiÕt bÞ ®Ó tiÕn hµnh c¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö phôc vô viÖc ®¸nh gi¸ theo dâi c©y chuyÓn gen nh­ PCR, lai Southern, RFLP, AFPD. Nh­ vËy, cã thÓ tiÕn hµnh chuyÓn gen vµ ®­a kü thuËt nµy vµo c«ng viÖc t¹o gièng c©y trång ë ViÖt Nam [1]. 1.2. C¸c kü thuËt Ph©n tÝch ph©n tö ADN c©y chuyÓn gen Cïng víi c¸c ph©n tÝch vµ ®¸nh gi¸ sù biÓu hiÖn cña gen chuyÓn ë c¸c c©y chuyÓn gen nh­ c¸c chØ tiªu ho¸ sinh, n«ng sinh, møc ®é kh¸ng s©u bÖnh, chèng chÞu c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh v.v., ph©n tÝch gen chuyÓn ë møc ph©n tö còng ®­îc tiÕn hµnh song song b»ng nhiÒu kü thuËt kh¸c nhau nh­ PCR, lai Southern, Western blost. Chóng t«i xin giíi thiÖu hai kü thuËt c¬ b¶n vµ quan träng ®Ó ph©n tÝch ph©n tö c©y chuyÓn gen lµ PCR vµ lai Southern. 1.2.1. Kü thuËt PCR Ph­¬ng ph¸p PCR (Polymerase Chain Reaction - ph¶n øng chuçi trïng hîp) do Karl Mullis vµ céng sù ph¸t minh n¨m 1985. Thùc chÊt ®©y lµ mét ph­¬ng ph¸p t¹o dßng ADN invitro kh«ng cÇn cã sù hiÖn diÖn cña tÕ bµo [5], [6]. 1.2.1.1. Nguyªn t¾c cña ph¶n øng PCR TÊt c¶ c¸c ADN polymeraza khi ho¹t ®éng tæng hîp mét m¹ch ADN míi tõ m¹ch khu«n ®Òu cÇn sù hiÖn diÖn cña nh÷ng ®o¹n måi. Måi lµ nh÷ng ®o¹n ADN ng¾n cã kh¶ n¨ng b¾t cÆp bæ xung víi mét ®Çu cña m¹ch khu«n tõ ®ã ADN polymeraza sÏ g¾n c¸c dNTP tù do ®Ó nèi dµi ®o¹n måi, h×nh thµnh m¹ch míi. Do ®ã, nÕu ta cung cÊp hai ®o¹n måi ®ÆchiÖu b¾t cÆp bæ xung víi 2 ®Çu cña mét tr×nh tù ADN (måi xu«i vµ måi ng­îc) ta sÏ tæng hîp ®o¹n ADN n»m gi÷a 2 måi ®ã [5], [9]. 1.2.1.2. Thµnh phÇn ph¶n øng PCR: Thµnh phÇn cña mét ph¶n øng PCR bao gåm ADN khu«n tøc lµ ®o¹n tr×nh tù ADN cÇn ®­îc nh©n lªn; 2 ®o¹n måi, mçi måi dµi 18-24 nucleotid; ADN polymeraza (th­êng hiÖn nay sö dông lµ Taq polymeraza - lµ mét lo¹i enzym chÞu nhiÖt); bèn lo¹i deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) vµ dung dÞch ®Öm vµ ion Mg2+ [12]. Ph¶n øng PCR tèi ­u khi ADN khu«n tinh s¹ch, nh­ng mét ­u ®iÓm lín cña ph­¬ng ph¸p PCR lµ cho phÐp nh©n c¶ nh÷ng mÉu ADN kh«ng ®­îc b¶o qu¶n tèt, ®· bÞ ph¸ huû tõng phÇn nh­ nh÷ng vÕt m¸u ®Ó l©u ngµy, tinh dÞch ®· kh«, ho¸ th¹ch, tãc, mãng tay cña ng­êi ®· chÕt... Måi lµ chØ tiªu quan träng nhÊt ®Ó ®¹t ®­îc mét sù khuyÕch ®¹i mét ®o¹n ADN ®Æc tr­ng. Måi lu«n g¾n víi ADN khu«n ë ®Çu 3’ vµ ADN Polymeraza kÐo dµi chuçi tæng hîp theo chiÒu 5’ ( 3’ [5]. Tr×nh tù måi, nhiÖt ®é g¾n måi vµ nång ®é trong ph¶n øng PCR lµ nh÷ng nh©n tè quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña ph¶n øng PCR. ViÖc chän måi còng ph¶i tu©n thñ mét sè nguyªn t¾c sau: Tr×nh tù cña måi ®­îc chän sao cho kh«ng cã sù b¾t cÆp bæ sung gi÷a måi “xu«i” vµ måi “ng­îc”, vµ còng kh«ng cã nh÷ng cÊu tróc “kÑp tãc” do sù b¾t cÆp bæ xung gi÷a c¸c phÇn kh¸c nhau cña mét måi. Tm cña måi xu«i vµ måi ng­îc kh«ng c¸ch biÖt nhau mét c¸ch qu¸ xa. C«ng thøc nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi: Tm=81,5 + 16,6(log10[J+] + 0,41(%G+C) - (600/I) - 0,63(% FA) Trong ®ã [J+] : Nång ®é c¸c cation ho¸ trÞ 1 FA : ChÊt dïng g©y biÕn tÝnh ADN I : ChiÒu dµi måi C¸c måi chän ph¶i ®Æc tr­ng cho tr×nh tù ADN cÇn khuyÕch ®¹i kh«ng trïng víi c¸c tr×nh tù lÆp l¹i trªn gen. Tr×nh tù n»m gi÷a 2 måi kh«ng qu¸ lín. Ph¶n øng PCR sÏ tèi ­u nÕu ®o¹n tr×nh tù nhá h¬n 1kb [5], [12]. Tr­íc ®©y trong ph¶n øng PCR ng­êi ta th­êng dïng ADN polymeraza I t¸ch chiÕt tõ E. coli vµ ADN polymeraza cña Phage T4. V× ®©y lµ enzyme kh«ng chÞu nhiÖt nªn thao t¸c phøc t¹p vµ hiÖu qu¶ thÊp (ph¶i thªm enzyme míi vµo sau mçi lÇn biÕn tÝnh v× enzyme cò ®· bÞ nhiÖt ph©n huû). ViÖc ph¸t hiÖn ra c¸c ADN polymeraza chÞu nhiÖt nh­ Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza, ®· cho phÐp qu¸ tr×nh nh©n b¶n ®­îc thùc hiÖn mét c¸ch tù ®éng ho¸. Th«ng dông nhÊt lµ Taq Polymerse ®­îc t¸ch ra tõ vi khuÈn chÞu nhiÖt Thermus aquaticus sèng ë suèi n­íc nãng 94-1000C. Enzym nµy cã ho¹t tÝnh cao nhÊt ë nhiÖt ®é 70-800C, cã träng l­îng ph©n tö lµ 94kD, gåm 832 axit amin do gen cã 2499 cÆp baz¬ tæng hîp nªn [28]. N¨m 1988, Saiki ®· chØ ra r»ng ho¹t tÝnh cña Taq polymeraza gi¶m 50% sau 130 phót ë nhiÖt ®é 92,50C, sau 40 phót ë 950C vµ sau 5-6 phót ë 970C. MÆt kh¸c, nång ®é ion Mg2+ vµ d NTP trong hçn hîp ph¶n øng còng ¶nh h­ëng rÊt nhiÒu ®Õn ho¹t tÝnh cña Taq polymeraza [14], [28]. Ngµy nay, nhiÒu enzym polymeraza chÞu nhiÖt kh¸c ®· ®­îc ®­a ra thÞ tr­êng víi nhiÒu chøc n¨ng chuyªn biÖt hay hoµn thiÖn h¬n. Tth pal lµ mét enzyme t¸ch tõ Thermus thermophilus cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng nh­ mét enzyme phiªn m· ng­îc khi cã mÆt cña ARN khu«n vµ Mg2+ , mÆt kh¸c Tth pal l¹i xóc t¸c ph¶n øng khuyÕch ®¹i ADN nÕu trong m«i tr­êng cã ADN khu«n vµ Mg2+. Bèn lo¹i nucleotit th­êng ®­îc sö dông ë nång ®é lµ 20 – 200 (M/mçi lo¹i nucleotit, nÕu sù mÊt c©n b¨ng trong thµnh phÇn c¸c nucleotit xÈy ra sÏ dÉn tíi c¸c lçi sao chÐp cña ADN polymeraza. Nång ®é ion Mg2+ còng lµ nh©n tè ¶nh h­ëng m¹nh ®Õn ph¶n øng PCR. Tuy nhiªn kh«ng cã mét quy luËt chung cho vÊn ®Ò nµy. Nång ®é tèi ­u ph¶i ®­îc x¸c ®Þnh cho tõng ph¶n øng qua thö nghiÖm. Trong thùc tÕ sè chu kú cña ph¶n øng PCR kh«ng v­ît qu¸ 40 chu kú. Së dÜ nh­ vËy lµ v× ph¶n øng PCR diÔn ra qua 2 giai ®o¹n. Trong giai ®o¹n ®Çu sè l­îng b¶n sao t¨ng theo cÊp sè nh©n tû lÖ víi l­îng mÉu ban ®Çu. Sau ®ã hiÖu qu¶ khuyÕch ®¹i gi¶m do c¸c nguyªn nh©n sau: Ho¹t tÝnh cña polymeraza gi¶m theo thêi gian ë nhiÖt ®é cao Sù c¹n kiÖt c¸c thµnh phÇn cña ph¶n øng. C¸c b¶n sao võa ®­îc tæng hîp kh«ng kÕt hîp víi måi mµ kÕt hîp víi nhau Sù xuÊt hiÖn cña c¸c s¶n phÈm phô øc chÕ ph¶n øng [5]. 1.2.1.3. C¸c b­íc cña ph¶n øng PCR Ph¶n øng PCR lµ mét chuçi gåm nhiÒu chu kú nèi tiÕp nhau mçi chu kú gåm 3 giai ®o¹n sau: Giai ®o¹n 1: BiÕn tÝnh ADN ë nhiÖt ®é tõ 94-950C trong thêi gian ng¾n 30 gi©y ®Õn 1 phót. §©y lµ giai ®o¹n m¹ch ®«i t¸ch thµnh 2 m¹ch ®¬n. Giai ®o¹n 2: G¾n måi, nhiÖt ®é ®­îc h¹ thÊp (thÊp h¬n Tm cña måi) cho phÐp c¸c måi b¾t cÆp víi khu«n. NhiÖt ®é nµy dao ®éng tõ 40-600C tuú thuéc vµo Tm cña måi mµ thêi gian b¾t cÆp kh¸c nhau. §©y lµ giai ®o¹n quyÕt ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng. Giai ®o¹n 3: Giai ®o¹n kÐo dµi. NhiÖt ®é t¨ng lªn 72 0C. §ã lµ ®iÒu kiÖn ®Ó cho Taq polymeraza ho¹t ®éng tæng hîp kÐo dµi m¹ch theo nguyªn t¾c bæ xung tõ 2 ®Çu sîi khu«n ban ®Çu. Theo Geifand vµ White (1990), tèc ®é tæng hîp cña Taq lµ 150 nucleotit/gi©y ë nhiÖt ®é 75oC - 80oC; 60 nucleotit/gi©y ë 70oC; 24 nucleotit/gi©y ë 55oC; 1,5 nucleotit/gi©y ë 37oC vµ ë nhiÖt ®é 22oC chØ cßn 0,25 nucleotit/gi©y [14]. Sau mét chu kú gåm ba giai ®o¹n nh­ trªn, mét ph©n tö ADN khu«n ®­îc nh©n lªn thµnh hai, c¸c ®o¹n ADN võa ®­îc nh©n trong chu kú l¹i lµm khu«n cho chu kú nh©n b¶n tiÕp theo v× hai ®Çu tËn cïng cña s¶n phÈm bæ sung víi måi. Do ®ã sau mçi chu kú sè l­îng ®o¹n ADN ®­îc tæng hîp sÏ t¨ng lªn gÊp ®«i vµ nh­ vËy sau n chu kú nh©n b¶n sÏ t¹o ra 2n b¶n ADN tõ mét khu«n ban ®Çu [6]. 1.2.1.4. øng dông cña kü thuËt PCR PCR lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu cho viÖc ph©n tÝch bé genom cña ®éng vËt vµ thùc vËt v× nã cho phÐp t¹o ra mét l­îng lín c¸c ®o¹n tr×nh tù ®Æc hiÖu. PCR cã nhiÒu øng dông vµo c¸c môc ®Ých kh¸c nhau, nh­ viÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù cña ADN ®­îc nh©n b¶n, nh©n b¶n quÇn thÓ mARN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh tr×nh tù ®Æc hiÖu tõ cADN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh sinh vËt chuyÓn gen. ph©n tÝch tiÕn ho¸, ph©n tÝch sù ®a d¹ng di truyÒn ë møc ®é ADN trong vµ gi÷a c¸c quÇn thÓ. HiÒn nay PCR ®­îc xem lµ mét ph­¬ng ph¸p nhanh vµ t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n ®Ó ph©n tÝch s¬ bé c©y chuyÓn gen [1]. 1.2.2. Kü thuËt lai Southern vµ øng dông 1.2.2.1. Nguyªn lý cña lai Southern Kü thuËt lai ph©n tö (molecular hybridization) nãi chung vµ lai Southern nãi riªng dùa trªn nguyªn lý lµ lai ph©n tö gi÷a mÉu dß ADN (ARN) víi c¸c ph©n tö ADN (ARN, protein) ®­îc l­u gi÷ trªn gi¸ thÓ ®Ó dß t×m c¸c ph©n tö sinh häc ®Æc tr­ng. Kü thuËt nµy cã hiÖu qu¶ cao trong nghiªn cøu ph¸t hiÖn c¸c ®¹i ph©n tö sinh häc cã cÊu tróc ph©n tö phøc t¹p. Nã cã thÓ ¸p dông cho mäi lo¹i ®¹i ph©n tö sinh häc cã kh¶ n¨ng g¾n kÕt vµo gi¸ thÓ l­u gi÷ nh­ mµng nitrocellulose, mµng nylon, mµng giÊy cellulose, nh­ng vÉn duy tr× ®­îc kh¶ n¨ng g¾n kÕt víi c¸c nhãm chÊt hiÓn thÞ kh¸c [1]. §èi víi ADN, ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc Edwind M. Southern x©y dùng vµ thö nghiÖm thµnh c«ng vµo n¨m 1975. ë ®©y, qu¸ tr×nh lai ph©n tö x¶y ra khi hai ®o¹n m¹ch ®¬n ADN b¾t cÆp vµ g¾n kÕt víi nhau trªn nguyªn t¾c bæ xung cho nhau. C¸c b­íc tiÕn hµnh trong kü thuËt nµy cã thÓ ®­îc tãm t¾t nh­ sau: ADN bé gen ®­îc c¾t thµnh nh÷ng ®o¹n cã kÝch th­íc kh¸c nhau b»ng mét hay nhiÒu enzym giíi h¹n (RE) vµ ®­îc ph©n t¸ch b»ng ®iÖn di trªn b¶n gel. ADN ®­îc biÕn tÝnh ngay trªn b¶n gel råi ®­îc thÊm truyÒn lªn mµng lai. Trong qu¸ tr×nh thÊm truyÒn vÞ trÝ c¸c ®o¹n ADN trªn mµng lai ®­îc gi÷ nguyªn nh­ trªn b¶n gel. ADN cè ®Þnh trªn mµng ®­îc ®em lai víi mÉu dß ADN cã ®¸nh dÊu b»ng phãng x¹ hoÆc ho¸ häc . Sau qu¸ tr×nh lai ng­êi ta röa mµng lai ®Ó lo¹i bá c¸c mÉu dß kh«ng b¾t cÆp. Cuèi cïng ng­êi ta dïng kü thuËt phãng x¹ hoÆc ho¸ häc tù ghi ®Ó ®Þnh vÞ c¸c ph©n tö lai vµ hiÓn thÞ trªn phim thµnh tõng b¨ng d¹ng v¹ch ngang. Kü thuËt nµy ®­îc gäi lµ kü thuËt ph©n tÝch mµng thÊm chuyÓn Southern (Southern blot analysis), gäi t¾t lµ lai Southern [1], [5]. Khi øng dông lai Southern ®èi víi c¸c ARN, kü thuËt nµy ®­îc ®Æt tªn lµ lai Northern. B­íc ph¸t hiÖn c¸c b¨ng ARN ®­îc tiÕn hµnh th«ng qua lai víi mÉu ADN hoÆc ARN ®¸nh dÊu. Cßn khi tiÕn hµnh kü thuËt nµy víi protein th× gäi lµ lai Western ®Ó ph¸t hiÖn c¸c b¨ng protien b»ng kh¸ng thÓ ®¸nh dÊu. Tíi nay ®· cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p c¶i tiÕn, h×nh thµnh nhiÒu kü thuËt phèi hîp nh­ Southwestern, ph¸t hiÖn b¨ng protein b»ng ADN ®¸nh dÊu hoÆc Western xa, dïng mÉu protein kh«ng ph¶i kh¸ng thÓ (non-antibody) [5]. VÒ nguyªn t¾c, kü thuËt thÊm chuyÓn kh«ng thay ®æi nhiÒu tõ khi ®­îc ph¸t minh, nh­ng chñng lo¹i c¸c mµng vµ kü thuËt ph¸t hiÖn c¸c lo¹i ®¹i ph©n tö th«ng qua lai ®¸nh dÊu hay miÔn dÞch ®¸nh dÊu kÌm víi c¸c bé kit lu«n ®­îc c¶i tiÕn cho tiÖn lîi vµ an toµn. Mµng nitrocellulose ®­îc dïng rÊt nhiÒu, nh­ng gÇn ®©y trong hai lo¹i mµng nylon trung tÝnh vµ mµng tÝch ®iÖn th× lo¹i mµng sau do tÝch ®iÖn nªn cã søc g¾n ADN cao h¬n. §­¬ng nhiªn trong kü thuËt Western, chÊt liÖu nitrocellulose vÉn ®ang ®­îc sö dông réng r·i, ngoµi ra cßn cã mµng polyvinylidene diflouride (PVDF) vµ mµng nylon [6]. ViÖc ph¸t hiÖn c¸c ph©n tö trªn mµng ®­îc tiÕn hµnh th«ng qua kü thuËt ®¸nh dÊu. Trong nhiÒu n¨m kü thuËt ®¸nh dÊu b»ng ®ång vÞ phãng x¹ ®· ®­îc øng dông mét c¸ch réng r·i, phæ biÕn nhÊt lµ g¾n c¸c nucleotide víi c¸c ®ång vÞ phãng x¹ 32P d¹ng 32P-dNTP. ¦u ®iÓm lín cña ph­¬ng ph¸p phãng x¹ nµy lµ cã ®é nh¹y rÊt cao, cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc vÕt ADN ë møc ng (10-9 g) vµ thÊp h¬n. Tuy nhiªn ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu phãng x¹ ®ßi hái phßng thÝ nghiÖm cã nh÷ng thiÕt bÞ kiÓm tra vµ b¶o ®¶m an toµn phãng x¹ ®ång bé. Nh÷ng n¨m gÇn ®©y kü thuËt phi phãng x¹ (non-radioactive) hay kü thuËt ®¸nh dÊu l¹nh (cold labelling) ®ang tõng b­íc thay thÕ kü thuËt phãng x¹. Trong ®ã næi bËt lµ kü thuËt ph¸t quang ho¸ häc kÝch ho¹t (Enhancing Chemical Luminecsence, ECL) vµ kü thuËt sö dông ®¸nh dÊu víi digoxigenin (DIG) [1]. 1.2.2.2. HÖ thèng phi phãng x¹ DIG HÖ thèng phi phãng x¹ DIG lµ ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu vµ ph¸t hiÖn axÝt nucleic rÊt nh¹y vµ h÷u hiÖu. HÖ thèng nµy mang nhiÒu tÝnh ­u viÖt nh­ an toµn, mÉu dß ®¸nh dÊu cã ®é bÒn cao vµ dung dÞch lai cã thÓ dïng l¹i vµi lÇn. So víi ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu b»ng chÊt phãng x¹, ph­¬ng ph¸p nµy còng cã thuËn lîi nh­ ®é nh¹y cao vµ ph«ng nÒn s¹ch. Nh­ng l¹i tr¸nh ®­îc nh÷ng bÊt lîi nh­ sù rñi ro trong khi sö dông chÊt phãng x¹, chÊt th¶i ®éc h¹i, thêi gian hiÖn phim l©u, tÝnh kh«ng bÒn cña mÉu dß ®· ®¸nh dÊu.
H×nh 1: CÊu tróc cña Alkali-labile Digoxigenin (DIG) - dUTP Trong hÖ thèng DIG, mÉu dß lµ ADN, ARN ®­îc ®¸nh dÊu b»ng c¸ch g¾n víi digoxigenin (DIG)