Khóa luận Thiết lập quy trình điện di protein sds– page và ứng dụng đánh giá phản ứng của cây lúa đối với thuốc sinh học kích kháng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐIỆN DI PROTEIN SDS– PAGE VÀ ỨNG DỤNG ĐÁNH GIÁ PHẢN ỨNG CỦA CÂY LÚA ĐỐI VỚI THUỐC SINH HỌC KÍCH KHÁNG Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: LÊ NGUYỄN PHÚC SƠN Thành Phố Hồ Chí Minh 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐIỆN DI PROTEIN SDS– PAGE VÀ ỨNG DỤNG ĐÁNH GIÁ PHẢN ỨNG CỦA CÂY LÚA ĐỐI VỚI THUỐC SINH HỌC KÍCH KHÁNG Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN LÊ NGUYỄN PHÚC SƠN Thành Phố Hồ Chí Minh 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ  Để có đƣợc thành quả ngày hôm nay, trƣớc tiên, con xin cảm ơn bố mẹ và gia đình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để con có thể yên tâm học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này. TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị ở, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng. Các anh chị ở Bộ môn Bảo vệ Thực vật, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Các thành viên lớp Công nghệ Sinh học 29 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT Đề tài “Thiết lập quy trình điện di protein SDS- PAGE và ứng dụng đánh giá phản ứng của cây lúa đối với thuốc sinh học kích kháng” do Lê Nguyễn Phúc Sơn thực hiện từ 15/03/2007 đến 31/08/2007 tại bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài là một hƣớng nghiên cứu phát triển của phƣơng pháp sinh học phân tử trong điều kiện phòng thí nghiệm, mà bƣớc đầu là hoàn thiện phƣơng pháp SDS– PAGE áp dụng trên protein của lá lúa. Quy trình trải qua các giai đoạn: 1. Chuẩn bị mẫu lá lúa 2. Ly trích protein của lá lúa 3. Điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích đƣợc từ lá lúa. Tóm lại, đề tài này đã thiết lập đƣợc quy trình SDS– PAGE trên đối tƣợng là protein của lá lúa nhƣng vẫn chƣa hoàn thiện đƣợc quy trình ở mức độ protein có độ tinh sạch cao. Kết quả trong đề tài này là cơ sở ban đầu trong việc hoàn thiện phƣơng pháp phân tích proteomics để phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật. v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................... iv MỤC LỤC ............................................................................................................... v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC BẢNG ......................................................... ix Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Mục đích ............................................................................................................. 2 1.3 Yêu cầu ............................................................................................................... 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 2.1 Vài điều sơ lƣợc về cây lúa ................................................................................ 3 2.1.1 Nguồn gốc và phân bố................................................................................... 3 2.1.2 Đặc điểm hình thái của lúa ............................................................................ 3 2.1.3 Đặc điểm hạt lúa ............................................................................................ 5 2.1.4 Điều kiện để hạt lúa nảy mầm ....................................................................... 5 2.1.4.1 Nƣớc ......................................................................................................... 5 2.1.4.2 Nhiệt độ .................................................................................................... 5 2.1.4.3 Không khí ................................................................................................. 6 2.2 Một số phƣơng pháp tách chiết protein tổng số từ thực vật ............................... 6 2.2.1 Quy trình có sử dụng SDS ............................................................................ 7 2.2.2 Quy trình có sử dụng phenol ......................................................................... 7 2.2.3 Quy trình có sử dụng PMSF.......................................................................... 8 2.3 Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide ................................................... 8 2.3.1 Sơ lƣợc về lịch sử gel polyacrylamide và sự phát triển của phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide ........................................................................................ 8 2.3.2 Gel polyacrylamide ....................................................................................... 9 2.3.3 Phƣơng pháp SDS- PAGE .......................................................................... 10 vi 2.3.4 Nhuộm gel sau khi điện di .......................................................................... 11 2.3.5 Một số yếu tố cần quan tâm trong điện di trên gel polyacrylamide ............ 13 2.3.6 Phƣơng pháp điện di hai chiều .................................................................... 14 2.4 Một số nghiên cứu liên quan đến điện di protein SDS- PAGE ....................... 16 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................... 16 2.4.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................................... 17 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .................................. 18 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................. 18 3.2 Hóa chất và vật liệu dùng trong thí nghiệm ..................................................... 18 3.2.1 Thuốc sinh học ............................................................................................ 18 3.2.2 Hóa chất dùng trong ly trích........................................................................ 18 3.2.3 Hóa chất điện di .......................................................................................... 19 3.2.4 Trang thiết bị thí nghiệm ............................................................................. 19 3.3 Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu .................................................................. 19 3.3.1 Chuẩn bị mẫu và lấy mẫu ............................................................................ 19 3.3.1.1 Chuẩn bị mẫu lúa ................................................................................... 19 3.3.1.2 Xử lý thuốc và lấy mẫu .......................................................................... 20 3.3.2 Ly trích protein tổng số từ lá lúa ................................................................. 21 3.3.2.1 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình có sử dụng SDS ..................... 21 3.3.2.2 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình có sử dụng phenol .................. 21 3.3.2.3 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình cải tiến có dụng SDS ............. 22 3.3.3 Điện di kiểm tra mẫu protein đã ly trích ..................................................... 23 3.3.3.1 Chuẩn bị hóa chất ................................................................................... 23 3.3.3.2 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di ................................................................ 24 3.3.3.3 Tiến hành điện di và xem kết quả .......................................................... 24 3.3.4 Thí nghiệm khảo sát chọn điều kiện điện di ............................................... 25 3.3.5 Khảo sát nồng độ gel ................................................................................... 25 3.3.6 Điện di các mẫu protein để kiểm tra phản ứng của cây lúa đối với thuốc sinh học kích kháng ................................................................................................ 26 vii Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 27 4.1 Kết quả ly trích protein tổng số ........................................................................ 27 4.2 Kết quả khảo sát chọn điều kiện điện di .......................................................... 29 4.3 Ảnh hƣởng của nồng độ gel đến kết quả điện di .............................................. 30 4.4 Đánh giá phản ứng của lúa đối với thuốc sinh học .......................................... 32 4.4.1 Kết quả điện di của tất cả các mẫu protein trong 12 nghiệm thức .............. 32 4.4.2 Kết quả điện di mẫu protein của lúa ở lô II ................................................. 33 4.4.3 Kết quả điện di mẫu protein của lúa ở lô III ............................................... 34 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 35 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 35 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 36 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2- DE Two- dimensional electrophoresis AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism APS ammonium persulfate CBB Coomassie Brilliant Blue DTT Dithiotheitol EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid HPLC High performance liquid chromatography IEF Isoelectric focusing KDa kilo Dalton PCR Polymerase Chain Reaction PVDF Polyvinylidene difluoride RADP Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SDS– PAGE Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis SNP Single Nucleotide Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats STS Sequence Tagged Site TEMED N,N,N’,N’-tetramethylenediamide SDS Sodium dodecyl sulfate TE Tris – EDTA w/v Weight for volume ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC BẢNG Hình 2.1 Hình thái cây lúa (Oryza sativa L.) ........................................................... 4 Hình 2.2 Cấu trúc protein trƣớc và sau khi làm biến tính bởi SDS ....................... 11 Hình 3.1 Lúa mầm trong hộp nhựa 2 ngày ............................................................ 20 Hình 4.1 Kết quả điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích của các quy trình ..... 28 Hình 4.2 Kết quả khảo sát điều kiện điện di phù hợp với protein lá lúa ................ 30 Hình 4.3 Kết quả điện di SDS– PAGE các mẫu protein khảo sát nồng độ gel...... 31 Hình 4.4 Kết quả điện di SDS– PAGE các mẫu protein của lúa trong 6 nghiệm thức (nghiệm thức 1, 2, 3,4, 5 và 6) ................................................................. 32 Hình 4.5 Kết quả điện di SDS– PAGE các mẫu protein của lúa trong 6 nghiệm thức (nghiệm thức 4, 5, 6, 7, 10 và 11). ........................................................... 32 Hình 4.6 Kết quả điện di SDS– PAGE các mẫu protein của lúa trong 5 nghiệm thức (nghiệm thức 5, 8, 9, 10 và 12). ............................................................... 32 Hình 4.7 Kết quả điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lô II...................... 33 Hình 4.8 Kết quả điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lô III .................... 34 Bảng 3.1 Bảng bố trí phân lô thí nghiệm theo nghiệm thức .................................. 20 Bảng 3.2 Thời gian xử lý thuốc trƣớc khi lấy mẫu theo từng nghiệm thức .......... 21 Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát điều kiện điện di .................................................... 25 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Lúa là cây lƣơng thực quan trọng, là nhu cầu không thể thiếu đối với con ngƣời, đặc biệt ở các nƣớc Châu Á. Việt Nam với đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió mùa, mƣa nhiều, ẩm độ cao, rất thích hợp cho việc trồng lúa. Mặt khác ngƣời Việt Nam còn có truyền thống canh tác cây lúa từ rất lâu đời. Trƣớc đây, với điều kiện vật chất còn thiếu thốn, lƣơng thực không đủ ăn ngƣời ta chỉ có nhu cầu đƣợc ăn no. Hiện nay với mức sống ngƣời dân ngày càng đƣợc nâng cao thì ngoài nhu cầu ăn no, việc ăn ngon, có dinh dƣỡng cao đã dần trở nên là nhu cầu quan trọng đối với mọi ngƣời. Nhƣng hiện nay các bệnh trên cây trồng ngày càng càng hoành hành dữ dội, gây cản trở trong sản xuất và phát triển ngành nông nghiệp. Ngày nay, với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trên thế giới cũng nhƣ trong nƣớc, định hƣớng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự chuyển hƣớng rõ rệt. Trƣớc hết là những đầu tƣ rất lớn để khai thác và ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh, sâu rầy hại, virus, cỏ dại và các loại côn trùng gây hại trong sản xuất nông nghiệp. Theo đó hƣớng ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu các chế phẩm sinh học có bản chất là các polyamin đang ngày càng phát triển. Đây là một hƣớng nghiên cứu mới có thể trở thành một công nghệ sạch trong phòng trừ sâu bệnh hại ở nƣớc ta nếu đƣợc đầu tƣ phát triển. Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học thì các kỹ thuật về sinh học phân tử đã ra đời nhƣ phƣơng pháp Southern blot, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RADP (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), SNP (Single Nucleotide Polymorphism), STS (Sequence Tagged Site), PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) tạo nên một sự chuyển biến rõ rệt trong các hƣớng nghiên cứu về acid nucleic. Tuy nhiên các phƣơng pháp sinh học phân tử 2 trên chỉ có thể tập trung nghiên cứu về gen và cấu trúc gen mà không thể cho ta biết đƣợc sự biểu hiện của gen. Đó là nguyên nhân dẫn đến sự ra đời của của các phƣơng pháp nhƣ sắc ký lỏng cao áp (HPLC), SDS– PAGE, Western blot, 2– D PAGE. Về nguyên tắc thì chúng có mối liên hệ với nhau và là cầu nối cho nhau. Trong đó, phƣơng pháp SDS– PAGE đƣợc xem là một kỹ thuật đơn giản mà đem lại hiệu quả cao và có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử. Trong phạm vi cho phép chúng tôi thực hiện đề tài: “Thiết lập quy trình điện di protein SDS- PAGE và ứng dụng đánh giá phản ứng của cây lúa đối với thuốc sinh học kích kháng”. 1.2 Mục đích Thiết lập quy trình ly trích protein tổng số từ lá lúa. Sử dụng phƣơng pháp điện di protein SDS– PAGE xác định phản ứng của cây lúa đối với thuốc sinh học kích kháng. 1.3 Yêu cầu Ly trích đƣợc protein tổng số từ lá lúa. Hoàn thiện kỹ thuật điện di SDS– PAGE trên protein của lúa. So sánh xem sự khác biệt về protein tổng số giữa mẫu lúa không xử lý thuốc polyamin với mẫu lúa xử lý thuốc polyamin ở nồng độ khác nhau. So sánh sự khác biệt về protein của các mẫu lúa có xử lý thuốc polyamin với nồng độ và thời gian tác động khác nhau. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vài điều sơ lƣợc về cây lúa 2.1.1 Nguồn gốc và phân bố Lúa là loại thực vật đƣợc canh tác từ rất lâu đời. Về nguồn gốc của lúa trồng chƣa đƣợc hiểu rõ ràng và có nhiều ý kiến khác nhau. Hiện nay trên thế giới có hai cây lúa trồng. Lúa trồng Oryza sativa đƣợc thuần hóa ở Châu Á, nên đƣợc gọi là lúa trồng Châu Á. Lúa trồng Oryza glaberrima đƣợc thuần hóa ở Châu Phi nên đƣợc gọi là lúa trồng Châu Phi (Bùi Huy Đáp, 1999). Các nhà khảo cổ học Mỹ cho rằng lúa trồng xuất hiện rất sớm cách đây khoảng hơn 9 – 10 nghìn năm. Nhiều nhà khảo cổ học khác cho là lúa trồng xuất hiện cách đây 6.000 năm, lúa trồng châu Phi (Oryza glaberrima) đã xuất hiện cách đây 3.500 năm. Còn một số tác giả khác cho là lúa trồng châu Phi xuất hiện rất muộn, chỉ sau công nguyên, cách đây khoảng 1.800 – 1.900 năm. (Bùi Huy Đáp, 1999) Về mặt phân bố thì cây lúa là loài thực vật có diện tích phân bố khá rộng, loài O. sativa phân bố kéo dài từ vĩ độ 35 độ Nam đến 50 độ Bắc trên 110 quốc gia. Diện tích gieo trồng chiếm khoảng 10% diện tích đất nông nghiệp trên thế giới (144 triệu ha). Lúa gạo đƣợc trồng từ độ cao bằng mực nƣớc biển đến độ cao 3.000 m so với mực nƣớc biển. Lúa đƣợc trồng từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới. Lúa gạo có thể đƣợc trồng trên nhiều loại đất khác nhau đất chua, đất kiềm, đất nhiễm phèn. Những dòng lúa có thể đƣợc phân chia thành 3 nhóm sinh thái, Indica (ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới), Javanica ( đƣợc trồng ở Indonesia) và Japonica (vùng ôn đới). Có hai dòng đƣợc canh tác nhiều nhất là Indica và Japonica. (Bùi Huy Đáp, 1999). 2.1.2 Đặc điểm hình thái của lúa Lúa trồng là cây thân thảo, hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, có thời gian sinh trƣởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng và các điều kiện sinh thái thời gian trồng kéo dài trong khoảng từ 75 – 250 ngày. 4 Thân cao từ 70 – 150 cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2 – 3 m, hay 5 – 6 m (lúa nổi ở Bangladesh). Đốt thân nhẵn và cách nhau bởi những lóng dài, ngắn khác nhau. Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp. Bẹ lá có thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ đều nhọn. Lúa thƣờng tạo ra thành nhiều nhánh (dảnh lúa: tillers), bao gồm cọng và lá có hoặc không có bông (panical). Nhánh bậc 1 xuất hiện từ những đốt gần thân chính và nhánh bậc hai, bậc ba xuất hiện từ những nhánh bậc một này. Lá mọc liên tiếp trên thân bao gồm bẹ lá bao lấy thân và phiến lá. Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ lá có một lƣỡi bẹ và 2 thìa lìa từ cổ lá. Bông mọc trên đốt trên cùng của thân từ bên trong lá cờ và mang nhiều hoa trong một bông con. Cụm hoa là một chùm thƣa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống, dài 15 – 30 cm hoặc dài hơn. Hoa nhỏ hình thuôn dài, mày hoa thuôn dài hình mũi mác, hoa màu hồng vàng hay màu tím, có hoa lƣỡng tính, tự thụ phấn. Hoa có 6 nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi, nhụy ngắn và hai đầu nhụy có lông tơ [11]. Về cơ bản, lúa là cây thích nghi với điều kiện có nƣớc. Ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây lúa theo viện nghiên cứu quốc tế IRRI là: (i) Giai đoạn tăng trƣởng: từ khi gieo hạt cho đến khi cây lúa làm đòng. (ii) Hình 2.1: Hình thái cây lúa (Oryza sativa L.) 5 Giai đoạn sinh sản: từ khi lúa làm đòng đến khi lúa trổ bông. (iii) Giai đoạn lúa chín: từ khi lúa trổ bông đến khi lúa chín. (Võ Tòng Xuân, 1986) 2.1.3 Đặc điểm hạt lúa Hạt lúa là một loại quả, thuộc loại quả dĩnh. Hình thái và màu sắc của hạt lúa tùy giống lúa. Lúa tiên (Indica) có hạt dài còn lúa cánh (Japonica) thì có hạt tròn. Đa số hạt lúa có màu vàng sáng, một số có màu vàng sẫm hoặc