Kỹ thuật nuôi cấy invitro và ứng dụng tạo cây sạch bệnh

PHẦN I: MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mũi nhọn, đang phát triển trên cơ sở các kĩ thuật mới mẻ: kĩ thuật di truyền, kĩ thuật dung hợp tế bào; kĩ thuật nuôi cấy mô; kĩ thuật nuôi cấy tế bào; kĩ thuật cấy chuyển phôi… Những thành tựu này đang chuẩn bị cho một cuộc cách mạng sinh học trong các ngành kinh tế-kĩ thuật. Phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng từ lâu bởi các nhà trồng hoa và các nhà chọn giống muốn nhân nhanh những giống đặc cấp, cải thiện hiệu quả của từng thời kì chọn lọc. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được tiến hành ở Việt Nam từ giữa những năm 70. Hiện nay, trong cả nước đã có vài chục phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào. Phần lớn các phòng thí nghiệm đang tiến hành những nghiên cứu ứng dụng: chủ yếu là kỹ thuật invitro trong ống nghiệm. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh còn có những khả năng đóng góp cho những nghiên cứu và ứng dụng xa hơn thế nữa, đặc biệt là trong cải biến di truyền và trong công nghệ thu nhận các chất có hoạt tính sinh học. Ở cây trồng khi bị nhiễm Virus thì sinh trưởng phát triển kém, năng suát phẩm chất thấp có thể ngừng sinh trưởng không cho thu hoạch. Việc nhiễm Virus ở cây trồng là nguyên nhân làm thoái hóa giống. Vì vậy yêu cầu đặt ra là tạo ra cây sạch bệnh. Làm sạch Virus là việc giải phóng Virus ra khỏi cây bị nhiễm Virus. Việc này có ý nghĩa to lớn trong phục tráng giống cây trồng bị thoái hóa do nhiễm bệnh virus cung cấp giống có chất lượng tốt cho sản xuất. Đề tài "kỹ thuật nuôi cấy invitro và ứng dụng tạo cây sạch bệnh" giúp cho mọi người có được những kiến thức cơ bản về chọn tạo giống cây trồng, về các hướng nghiên cứu và ứng dụng đã được tiến hành thành công. PHẦN II: NỘI DUNG 1. Cơ sở di truyền của phương pháp tạo cây sạch bệnh. - Virus là một loại bệnh không thể chữa được. -Bệnh Virus gây tổn thất lớn về năng suất, phẩm chất. - Bệnh Virus lan truyền qua các thế hệ khi nhân giống vô tính gây ra hiện tượng thoái hóa giống: khoai tây, khoai lang, các loại hoa trồng từ củ hoặc cành giâm . - Việc tạo ra các giống sạch Virus là biện pháp bắt buộc phải tiến hành cho tất cả các cây nhân giống vô tính và cũng là một biện pháp phục tráng giống cho các giống đã bị thoái hóa do virus. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thực chất là nuôi cấy invitro, bộ phận nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng có chứa từ 1 đến vài lá non. Những cây được tạo ra từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có độ đồng đều cao vì chúng được sinh ra từ những tế bào ít hoặc chưa bị phân hóa như những tế bào ở nơi khác. Các giả thiết giải thích tế bào sinh trưởng sạch Virus: + Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống mô dẫn nhưng hệ thống này chưa có ở mô phân sinh do đó Virus không thể vào được tế bào mô phân sinh. + Tại mô phân sinh đỉnh tế bào có tốc độ phân chia cao không đồng nhất với tốc độ nhân bản vật chất di truyền của tế bào Virus và khi tế bào mô phân sinh phân chia không sao chép thông tin di truyền của Virus. + Mô phân sinh đỉnh là nơi tổng hợp auxin nên thường có hàm lượng cao, có tác dụng ngăn cản và ức chế sự sao chép vật chất di truyền của Virus. 2. Thành tựu của kỹ thuật tạo cây sạch bệnh: Đầu năm 1949, Limmaset và Cornuet đã chứng minh được Virus phân bố ở trong cây theo quy luật càng gần đỉnh sinh trưởng mật độ Virus càng giảm. Năm 1952, Morel và Martin là những người đầu tiên tạo ra cây thược dược khỏe từ cây bệnh thông qua con đường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ đó đã được áp dụng rộng rãi để nhân vô tính cây sạch bệnh Virus ở nhiều loài. - Năm 1978, Walkey đã tạo ra cây thuốc lá và cây đậu ngựa sạch Virus từ những cây thuốc lá bị nhiễm bệnh TMV và đậu ngựa bị nhiễm bệnh CMV. - Kartha và Gamborg tạo ra 100% cây sắn sạch Virus bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của cây bị bệnh. 3. Kỹ thuật tạo cây sạch bệnh * Điều kiện cần thiết của nuối cấy in vitro Điều kiện trước tiên là vô trùng. Tất cả các khâu nuôi cấy đều được thanh trùng: dụng cụ nuôi cấy, mẫu nuôi cấy, môi trường (giá thể) và các thao tác nuôi cấy…Sự thành công hay thất bại của công việc nuôi cấy mô là phụ thuộc vào việc vô trùng. Nếu có một khâu nào đó không vô trùng thì mẫu nuôi cấy lập tức bị nhiễm trùng và sẽ chết. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô là phòng thí nghiệm chuyên hóa cao với các thiết bị chuyên dụng, bao gồm một phòng chuẩn bị mẫu, phòng cấy mẫu, phòng nuôi cây và nhà lưới để đưa cây ra đất. Môi trường nuôi cấy là giá thể có đầy đủ chất dinh dưỡng, các hoạt chất như vi lượng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng. * Quy trình kỹ thuật tạo cây sạch bệnh: * Trình tự thực hiện: Chọn những cây khỏe mạnh đem trồng trong nhà kính. Nuôi dưỡng cây ở nhiệt độ 380C, chăm sóc cho cây sinh trưởng, phát triển tốt. Lấy mẫu cây là chồi đỉnh với kích thước từ 0,2 – 1 mm để khử Virus. Cấy mẫu vào môi trường và nuôi dưỡng trên giàn lắc trong 3 – 4 tuần nhân chuyển 1 lần cho đến khi đạt đến số lượng chồi nhất định. - Tách và nuôi trên nền thạch agar để thúc chồi và thúc rễ. Sử dụng môi trường: MS + IAA + GA3. Ra ngôi cây trong lồng lưới ( mỗi cây được đặt trong 1 lồng lưới riêng). Kiểm tra Virus (Test): bằng các phương pháp: + Sử dụng cây chỉ thị + Phương pháp Huyết Thanh + Phương pháp Elisa + Sử dụng Kính hiển vi điện tử + Phương pháp lai DNA Khi kiểm tra sẽ có 2 khả năng xảy ra: + Khả năng 1: Dương tính ( Vẫn còn Virus). + Khả năng 2: Âm tính (đã sạch Virus). Những mẫu sạch Virus sẽ được tiến hành nhân nhanh để tạo thành cây con thương phẩm theo quy trình nuôi cấy mô tế bào. - Nếu cần bảo tồn và lưu giữ nguồn gen thì dùng phương pháp lạnh sâu. 4. Ứng dụng của kỹ thuật tạo cây sạch bệnh trên cây Lan * Quy trình nuôi cấy tạo hoa Lan sạch bệnh: * Bước 1: Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy: Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần lượt các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng. Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70% trong 30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25 phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy. Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4 - 5 lần. Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non. Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 700C trong 1 giây và rửa với nước cất vô trùng. Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng. Dùng dao nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trường nhân giống ban đầu. * Bước 2: Nhân giống: Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokinin,…). Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyền sau đó. * Bước 2: Nhân giống: Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây... nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyền và thể tích cũng không quá 10% thể tích môi trường. Ví dụ môi trường đối với Lan Hồ điệp là: MS+ 1ppm BAP + 1ppm Kinetine + 5% nước dừa, khoai tây, chuối xanh + 0,1% than + 40g đường + 6g agar. Nhiệt độ để nhân giống Lan là 220C– 260C và tuỳ vào mỗi loài. Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi. Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước của chồi. Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi). Mỗi đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và cấy chuyền sang môi trường mới. * Bước 3: Tái sinh cây hoàn chỉnh in-vitro: Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ). Sau 4 -5 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con. Ví dụ đối với cây lan Hồ Điệp, môi trường sử dụng là: MS + 1ppm NAA + 0,1% than + 40g đường + 6g agar * Bước 4: Chuyển cây ra vườn ươm Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng. Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật Như vậy, từ một mô hoa Lan được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá chuyển ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng. Với phương pháp nhân giống invitro như trên sẽ đảm bảo tạo ra cây con mang đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con không nhiễm bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, việc cấy mô phải được thực hiện thật nghiêm túc và tỉ mỉ theo đúng quy trình, phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt. Cần chú ý thêm, đối với các loài không phải là cây bản địa, phải được thuần hoá tại vùng mới chọn mẫu đem nuôi cấy, có như vậy mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm. => Kết quả sau các bước trên ta thu được cây invitro sạch bệnh. PHẦN III: TRIỂN VỌNG Kỹ thuật nhân in vitro bằng phương pháp tạo cây sạch bệnh trong môi trường lỏng khắc phục được các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính như chiết, ghép, giâm… có thể nhân số lượng lớn và giữ nguyên các đặc điểm tốt của các dòng vô tính ưu tú đã được tuyển chọn có năng suất cao, chất lượng tốt và khả năng kháng bệnh cao. Trong tương lai tạo ra số lượng lớn cây sạch bệnh có độ đồng đều cao phục tráng được các giống cây trồng nổi tiếng thoái hóa do nhiễm bệnh Virus cung cấp giống có chất lượng tốt cho sản xuất.