Luận án Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên miễn dịch và khả năng kháng khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HỒNG MỘNG HUYỀN ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT THẢO DƯỢC LÊN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VI KHUẨN TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ NGÀNH 62620301 2024 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ HỒNG MỘNG HUYỀN MÃ SỐ NGHIÊN CỨU SINH P0616006 ẢNH HƯỞNG CỦA CHIẾT XUẤT THẢO DƯỢC LÊN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VI KHUẨN TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ NGÀNH 62620301 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. TRẦN THỊ TUYẾT HOA 2024 192 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô PGS.TS. Trần Thị Tuyết Hoa đã dành nhiều thời gian, công sức và tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận án và theo học tại trường. Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô TS. Bùi Thị Bích Hằng, Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình hướng dẫn chuyên đề nghiên cứu sinh. Xin được gửi lời cảm ơn đến Thầy GS.TS. Trần Ngọc Hải, PGS.TS. Lê Quốc Việt, PGS. TS. Nguyễn Trọng Tuân, TS. Huỳnh Văn Hiền, Cô TS. Đặng Thụy Mai Thy, Chị TS. Trần Thị Mỹ Duyên và toàn thể Thầy Cô Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ; quý Thầy/Cô và các Anh/Chị em bộ môn Bệnh học Thủy sản đã sắp xếp công việc cũng như tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập. Cảm ơn các hộ nuôi nuôi tôm ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng đã cung cấp thông tin khảo sát về thảo dược trong nuôi tôm. Chân thành biết ơn các anh chị thuộc chi cục Thủy sản, trung tâm khuyến nông khuyến ngư tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng đã nhiệt tình hỗ trợ trong quá trình thu thập số liệu. Cảm ơn các Anh/Chị nghiên cứu sinh khóa 2016; sự hỗ trợ tích cực của các anh, em học viên cao học: Nguyễn Văn Toàn, Thura Win, Võ Tấn Huy, và các em sinh viên: Nguyễn Thị Quế Anh, Nguyễn Văn Thanh, Hà Thị Tuyết Nhi, Quách Thị Tiểu Nguyệt, Nguyễn Thị Huyền My, Bùi Văn Phiên, Nguyễn Quốc Khánh, Lê Kim Ngọc, Nguyễn Văn Khỏe, Phạm Minh Nhựt, Nguyễn Quí Nhân, Lê Khánh Tường, Nguyễn Thị Mỹ Ngân, Đặng Thị Bé Thảo. Cuối cùng, sự thành công của luận án không thể không kể đến sự đóng góp không nhỏ của các thành viên trong gia đình, những người luôn ủng hộ, động viên và giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn trong thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn./. NCS. HỒNG MỘNG HUYỀN i TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định được loài thảo dược có khả năng tăng cường miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm thẻ chân trắng. Nội dung nghiên cứu bao gồm: (1) Khảo sát tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm biển ở tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng thuộc vùng ĐBSCL; (2) Nghiên cứu sàng lọc chọn ra một số loài thảo dược có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi gây bệnh trên tôm; (3) Xác định khả năng tăng cường miễn dịch trên tôm của một số chất chiết thảo dược; (4) Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng. Thảo dược hay các sản phẩm thảo dược được sử dụng chủ yếu ở mô hình nuôi tôm thâm canh (chiếm 90,9%, n= 20/22) và siêu thâm canh (chiếm 78,8%, n= 52/66) ở Cà Mau và Sóc Trăng, áp dụng trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Nghiên cứu xác định được 18 loài thực vật đang được sử dụng trong nuôi tôm. Trong đó, các loài thực vật được dùng phổ biến bao gồm tỏi (Allium sativum) (73,6%, n= 53/72); diệp hạ châu (Phyllanthus spp.) (45,8%, 33/72); ổi (Psidium guajava) (12,5%, n= 9/72); mật gấu (Vernonia amygdalina) (8,3%; n= 6/72); thù lù (Physalis angulata) (8,3%, n= 6/72). Các loài thảo dược tiềm năng tập trung ở bộ sơ ri (diệp hạ châu, mần ri), bộ cà (thù lù), bộ cúc (mật gấu, cỏ mực), bộ đào kim nương (ổi), bộ húng (ô rô). Trong tổng số 15 loài thảo dược phổ biến ĐBSCL được lựa chọn để xác định hoạt tính kháng khuẩn thì có 6 loài thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao (nhạy) trên cả vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5) và V. harveyi (T2016-04). Cụ thể, chất chiết bàng, lựu, diệp hạ châu thân đỏ, diệp hạ châu thân xanh, bần ổi, bần chua có đường kính vòng kháng khuẩn dao động từ 14,7 mm đến 21,7 mm. Tất cả 6 chất chiết này đều có tính kìm khuẩn đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus, V. harveyi với giá trị MIC (0,095 đến 1,56 mg/mL) và MBC (6,25 đến 25 mg/mL). Ngoài ra, 6 chất chiết thảo dược này cũng có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với các chủng vi khuẩn phân lập từ ao nuôi tôm thuộc các vùng nuôi khác nhau ở ĐBSCL. Nghiên cứu cũng xác định chất chiết ổi chỉ có hoạt tính kháng khuẩn đối với V. parahaemolyticus nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn đối với V. harveyi; ngược lại chất chiết tỏi có hoạt tính kháng V. harveyi nhưng không có hoạt tính kháng V. parahaemolyticus. Tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung 1% và 2% chất chiết bàng, lựu, diệp hạ châu thân đỏ, bần ổi và bần chua liên tục trong 4 tuần không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và hệ số chuyển đổi thức ăn. Cụ thể, tăng trưởng hàng ngày dao động 0,14 đến 0,19 g/con, tốc độ tăng trưởng đặc biệt dao ii động từ 5,95 đến 6,71%/ngày. Hệ số chuyển đổi thức ăn dao động từ 0,95 đến 1,36. Tỷ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức thí nghiệm dao động từ 80,3-90,4%. Chế độ ăn bổ sung chất chiết lá bàng (T. catappa) (1%), chất chiết quả bần chua (S. caseolaris) (1%, 2%) trong 4 tuần liên tục giúp tôm thẻ chân trắng tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua tăng cường các chỉ số huyết học, hoạt tính PO, hoạt tính SOD, mức độ biểu hiện các gen miễn dịch (crustin, lysozyme và penaeidin-3a) và tăng tỷ lệ sống khi gây nhiễm thực nghiệm với V. parahaemolyticus. Tỷ lệ chết tích lũy ở nghiệm thức bổ sung 2% chất chiết bần chua (35,6%); 1% chất chiết bàng (44,5%); 1% chất chiết bần chua (46,7%) thấp hơn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (71,1%). Kết quả thử nghiệm ghi nhận chất chiết bàng (1%) và bần chua (1%) với nhịp bổ sung liên tục (trong tháng đầu thả nuôi) và nhịp bổ sung 2 tuần (tháng thứ 2) giúp cải thiện sức khỏe tôm thẻ chân trắng, gia tăng các thông số miễn dịch không đặc hiệu và gia tăng tỷ lệ sống khi cảm nhiễm với V. parahaemolyticus. Chất chiết từ methanol của lá bàng và quả bần chua được xác định có chứa các hợp chất sinh học bao gồm alkaloids, flavonoids, steroid và triterpenoids, đường khử, tannins và sesquiterpene lactones. Như vậy, đây là nghiên cứu đầu tiên xác định được chất chiết quả bần chua có hiệu quả trong tăng cường các thông số miễn dịch và khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nuôi thương phẩm. Từ khóa: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính, bàng, bần chua, chất chiết thảo dược, đáp ứng miễn dịch, tôm thẻ chân trắng iii ABSTRACT The study aimed to determine medicinal plants that can enhance the immune response and disease resistance of whiteleg shrimp (Penaeus vannamei) to Vibrio parahaemolyticus causing AHPND. The research content includes (1) surveying the current status and potential of herb usage in shrimp farming in Ca Mau and Soc Trang provinces in the Mekong Delta; (2) screening for herbal extracts that are resistant to Vibrio parahaemolyticus and V. harveyi causing diseases in shrimp; (3) determining the efficiency of the screened extracts in shrimp immunity enhancement; (4) testing the screened extracts in whiteleg shrimp to prevent acute hepatopancreatic necrosis. The investigation showed that in Ca Mau and Soc Trang provinces, medicinal plants or herbal products were mostly used for both black tiger shrimp and whiteleg shrimp in intense shrimp farming (accounted for 90.9%, n=20/22) and super-intensive shrimp farming (accounted for 78.8%, n=52/66). Eighteen species of herbs have been used for shrimp farming. The most common was Allium sativum, which accounted for 73,6% (n=53/72), followed by Phyllanthus spp. (45,8%, 33/72); Psidium guajava (12,5%, n=9/72); Vernonia amygdalina) (8,3%; n=6/72) and Physalis angulata (8,3%, n=6/72). The majority of potential herbs belong to some orders such as Malpighiales, Solanales, Asterales, Myrtales and Lamiales. Among fifteen medicinal plants being chosen to determine their antibacterial activity, six medicinal plants had strong antibacterial activities (sensitive) against both V. parahaemolyticus (CM5), and V. harveyi (T2016- 04). In the test of agar diffusion, Terminalia catappa, Punica granatum, Phyllanthus amarus, P. urinaria L., Sonneratia ovata and S. caseolaris had the diameter of inhibition zones ranging from 14.7 mm to 21.7 mm. Moreover, those six extracts were bacteriostatic. Their values of MIC (minimum inhibitory concentration) and MBC (minimum bacterial concentration) values for both V. parahaemolyticus and V. harveyi varied from 0.095 to 1.56 mg/mL and from 6.25 to 25 mg/mL, respectively. In addition, these herbal extracts had strong activity against the isolated bacteria from farmed shrimp in the Mekong Delta. In addition, the guava extract had a strong effect on V. parahaemolyticus but not on V. harveyi; meanwhile, the garlic was the opposite results. Whiteleg shrimp (P. vannamei) fed with the diet supplement of 1% and 2% of Terminalia catappa, Punica granatum, Phyllanthus amarus, P. urinaria L., Sonneratia ovata, and S. caseolaris in 4 continuous weeks, there were no iv significant effects on shrimp growth, survival rate, or feed conversion ratio. In detail, weight gain and specific growth rate were 0,14 to 0,19 g/shrimp and 5,95 to 6,71%/day. Survival rates ranged from 80.3% to 90.4%. The feed conversion ratio was from 0,95 to 1,36. Being fed constantly with the extract of T. catappa (1%), S. caseolaris (1%, 2%) for 4 weeks, the whiteleg shrimp had an enhancement of non-specific immune response, which was indicated through higher values of the hematological parameters, PO activity, SOD activity, gene expression of crustin, lysozyme, penaeidin-3a) and resistance to V. parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease in comparison with the control (P<0.05). In detail, the cumulative mortality in the treatments of 2% S. caseolaris (35,6%); 1% T. catappa (44,5%); 1% S. caseolaris (46,7%) was much lower than in the control treatment (71,1%). The results revealed that T. catappa L. and S. caseolaris (1%) extracts with continuous supplementation (in the first month of stocking) and 2-week interval supplementation (from the 2nd month of stocking) enhanced shrimp health, boosted non-specific immunological parameters and increased survival rate when being challenge against V. parahaemolyticus. The extracts of T. catappa L. and S. caseolaris both contained bioactive compounds such as alkaloids, flavonoids, steroids, triterpenoids, reduced sugars, tannins, and sesquiterpene lactones. In conclusion, this is the first study showed that the extract of S. caseolaris was able to improve immunological parameters and resistance to acute hepatopancreatic necrosis in shrimp farming. Keywords: Acute hepatopancreatic necrosis disease, herbal extract, immune response, Penaeus vannamei, Terminalia catappa L., Sonneratia caseolaris. v LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Hồng Mộng Huyền, là NCS ngành nuôi trồng thủy sản, khóa 2016. Tôi xin cam đoan luận án “Ảnh hưởng của chiết xuất thảo dược lên đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” là công trình nghiên cứu khoa học thực sự của bản thân tôi được sự hướng dẫn của PGS. TS. Trần Thị Tuyết Hoa. Đề tài này được tài trợ bởi Dự án Nâng cấp Trường Đại học Cần Thơ (VN14-P6) bằng nguồn vốn vay ODA từ chính phủ Nhật Bản (Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng hóa sinh và hóa - dược trong nuôi trồng thủy sản). Do đó, số liệu nghiên cứu sẽ được sử dụng trong khuôn khổ dự án. Các thông tin được sử dụng tham khảo trong đề tài luận án được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố rộng rãi và được tôi trích dẫn nguồn tham khảo rõ ràng ở phần Danh mục tài liệu tham khảo. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án này là do chính tôi thực hiện một cách nghiêm túc, trung thực và không trùng lắp với các đề tài khác đã được công bố trước đây. Tôi xin lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảm bảo cho lời cam đoan này. Cần Thơ, ngày tháng năm 2024 Cán bộ hướng dẫn chính Tác giả thực hiện (Ký tên) (Ký tên) Trần Thị Tuyết Hoa Hồng Mộng Huyền vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................i TÓM TẮT ....................................................................................................... ii ABSTRACT ....................................................................................................iv LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................vi MỤC LỤC .................................................................................................... vii DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................xi DANH SÁCH HÌNH ................................................................................... xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................xvi CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ............................................................................ 1 1.1 Tính cấp thiết của luận án ........................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án ................................................................ 3 1.3 Nội dung nghiên cứu của luận án ............................................................... 3 1.4 Những đóng góp mới của luận án ............................................................... 5 1.5 Ý nghĩa thực tiễn của luận án ..................................................................... 6 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 7 2.1 Đặc điểm sinh học, tình hình nuôi và tiêu thụ tôm thẻ chân trắng ............. 7 2.1.1 Đặc điểm sinh học ................................................................................... 7 2.1.2 Tình hình nuôi và tiêu thụ tôm thẻ chân trắng ......................................... 8 2.2 Một số bệnh vi khuẩn và hệ miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng ............... 14 2.2.1 Một số bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng ...................................... 14 2.2.1.1 Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ............................................................. 14 2.2.1.2 Bệnh phát sáng do vi khuẩn Vibrio harveyi ....................................... 20 2.2.1.3 Giải pháp phòng trị vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên tôm ..................... 23 2.2.2 Hệ miễn dịch trên tôm ........................................................................... 26 2.2.2.1 Thành phần và chức năng của hệ miễn dịch không đặc hiệu ............. 26 2.2.2.2 Yếu tố môi trường tác động đến đáp ứng miễn dịch .......................... 31 2.3 Thảo dược và tác dụng của thảo dược trong nuôi tôm ............................. 31 2.3.1 Sơ lược về thảo dược ............................................................................. 31 2.3.2 Thành phần loài và phương pháp bổ sung thảo dược trong nuôi trồng thủy sản ........................................................................................................... 34 vii 2.3.3 Vai trò của thảo dược trong nuôi trồng thủy sản ................................... 35 2.3.3.1 Hoạt tính kháng vi khuẩn .................................................................... 36 2.3.3.2 Khả năng kích thích miễn dịch ........................................................... 40 2.3.4 Cơ chế tác động của các chất chiết xuất thảo dược và yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng của thảo dược ............................................................................ 43 2.3.4.1 Cơ chế kháng khuẩn của thảo dược .................................................... 43 2.3.4.2 Một số hợp chất và cơ chế tác động của thảo dược đến hệ miễn dịch ................................................................................................................. 44 2.3.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến thảo dược trong nuôi trồng thủy sản ........ 45 2.3.5 Đặc điểm thảo dược vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long ........................ 48 2.3.5.1 Bàng .................................................................................................... 49 2.3.5.2 Lựu ...................................................................................................... 51 2.3.5.3 Diệp hạ châu đỏ .................................................................................. 53 2.3.5.4 Bần ổi .................................................................................................. 54 2.3.5.5 Bần chua ............................................................................................. 55 2.3.5.6 Một số loại thảo dược khác................................................................. 56 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 65 3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................ 65 3.1.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm .......................................................... 65 3.1.2 Vật liệu thí nghiệm ................................................................................ 65 3.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm .............................................................. 65 3.1.4 Môi trường và hóa chất thí nghiệm ....................................................... 66 3.2 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 67 3.2.1 Xác định tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ở một số địa phương thuộc vùng ĐBSCL ......................................................... 67 3.2.1.1 Địa điểm và số lượng hộ nuôi tôm ..................................................... 67 3.2.1.2 Phương pháp phỏng vấn hộ nuôi tôm ................................................. 68 3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của chất chiết thảo dược ......................... 68 3.2.2.1 Phương pháp ly trích thảo dược.......................................................... 68 3.2.2.2 Phương pháp phục hồi, nuôi và định danh vi khuẩn .......................... 68 3.2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn.................................... 70 3.2.2.4 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu ................................ 71 3.2.2.5 Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu .......................... 71 viii 3.2.2.6 Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh ........................................... 72 3.2.3 Thí nghiệm xác định khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, kháng bệnh và tăng trưởng của chất chiết thảo dược ở tôm thẻ chân trắng .............. 73 3.2.3.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng .................................... 73 3.2.3.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ................................................ 75 3.2.3.3 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng đề kháng mầm bệnh vi khuẩn của tôm thẻ chân trắng ................................... 77 3.2.4 Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng ............................................................... 78 3.2.4.1 Thí nghiệm bổ sung chất chiết thảo dược cho tôm thẻ chân trắng ..... 79 3.2.4.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ............................................................................ 80 3.2.4.3 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng phòng AHPND của tôm thẻ chân trắng .......................................................... 80 3.2.4.4 Định tính một số thành phần hợp chất hóa học trong chất chiết bàng và bần chua ..................................................................................................... 81 3.3 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 81 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 82 4.1 Tình hình và tiềm năng sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ở Cà Mau và Sóc Trăng ........................................................................................................ 82 4.1.1 Đặc điểm hộ nuôi và kỹ thuật nuôi ........................................................ 82 4.1.2 Tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ........................................ 84 4.1.3 Tiềm năng và nhu cầu sử dụng thảo dược trong nuôi tôm .................... 87 4.2 Hoạt tính kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus, V. harveyi của chất chiết thảo dược ........................................................................................................ 90 4.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược ................................... 90 4.2.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của chất chiết thảo dược ................................................................................. 97 4.2.3 Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh ......................................... 102 4.2.3.1 Phân lập V. parahaemolyticus và V. harveyi từ ao nuôi tôm ........... 102 4.2.3.2 Khảo sát khả năng ứng dụng chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn phân lập từ ao tôm bệnh ......................................... 105 ix 4.3 Xác định khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, kháng bệnh và tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng khi sử dụng một số chất chiết thảo dược ..... 106 4.3.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng ................................... 106 4.3.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng .............................................. 110 4.3.3 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng đề kháng mầm bệnh vi khuẩn của tôm thẻ chân trắng ...................................... 117 4.4 Thử nghiệm sử dụng chất chiết thảo dược trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng ............................................................. 122 4.4.1 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến hệ miễn dịch của tôm thẻ chân trắng .......................................................................... 123 4.4.1.1 Tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng ................................................. 123 4.4.1.2 Tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng................................. 125 4.4.2 Ảnh hưởng của chế độ ăn bổ sung chất chiết thảo dược đến khả năng phòng AHPND của tôm thẻ chân trắng ........................................................ 131 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................... 138 5.1 Kết luận ................................................................................................... 138 5.2 Kiến nghị ................................................................................................ 139 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 140 PHỤ LỤC .................................................................................................... 174 PHỤ LỤC 1: Nội dung phiếu khảo sát ......................................................... 174 PHỤ LỤC 2: Một số thông tin về hộ nuôi tôm được khảo sát ..................... 180 PHỤ LỤC 3: Thông tin thảo dược sử dụng trong nghiên cứu ..................... 185 PHỤ LỤC 4: Một số loại hóa chất sử dụng trong phân tích THC, GC, HC 186 PHỤ LỤC 5: Kết quả phân tích thống kê ..................................................... 187 PHỤ LỤC 6: Số lượng tôm thẻ chân trắng chết hàng ngày khi cảm nhiễm V. parahaemolyticus .......................................................................................... 211 PHỤ LỤC 7: Thí nghiệm xác định giá trị LD50 ........................................... 215 PHỤ LỤC 8: Một số hình ảnh trong quá trình nghiên cứu .......................... 217 x DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Cơ chế gây bệnh của V. harveyi ...................................................... 21 Bảng 2.2: Vai trò của tế bào máu tôm ............................................................. 27 Bảng 2.3: Các loại thảo dược giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu trên tôm (Harikrishnan et al., 2011a) ....................................................... 41 Bảng 2.4: Cơ chế diệt khuẩn của các nhóm hợp chất chính cô lập từ thực vật. ......................................................................................................................... 44 Bảng 2.5: Công dụng của cây bàng T. catappa L............................................ 50 Bảng 2.6: Thành phần hóa học của lựu ........................................................... 52 Bảng 3.1: Thông tin tổng quát của các hộ phỏng vấn về tình hình sử dụng thảo dược trong nuôi tôm ........................................................................................ 68 Bảng 3.2: Trình tự mồi sử dụng trong các phản ứng realtime PCR ................ 77 Bảng 4.1: Thông tin về đặc điểm của các hộ nuôi tôm ................................... 82 Bảng 4.2: Các thông số kỹ thuật về ao nuôi, mật độ thả, tỉ lệ sống và giá trị kinh tế của các hộ nuôi tôm ..................................................................................... 83 Bảng 4.3: Thông tin về tình hình sử dụng thảo dược trong các hộ nuôi tôm ở Cà Mau và Sóc Trăng ............................................................................................ 84 Bảng 4.4: Cách thức sử dụng thảo dược trong quá trình nuôi tôm ................. 85 Bảng 4.5: Đánh giá về công dụng của thảo dược trong nuôi tôm ................... 86 Bảng 4.6: Các loại sản phẩm phòng trị bệnh hộ nuôi lựa chọn sử dụng trong nuôi tôm ........................................................................................................... 90 Bảng 4.7: Hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược đối với V. parahaemolyticus (CM5) và V. harveyi (T2016-04) ....................................... 91 Bảng 4.8: Kết quả MIC và MBC của chất chiết thảo dược đối với V. parahaemolyticus ............................................................................................. 98 Bảng 4.9: Kết quả MIC và MBC của chất chiết thảo dược đối với V. harveyi (T2016-04) ....................................................................................................... 99 Bảng 4.10: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm ở ao nuôi ........... 103 Bảng 4.11: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập từ tôm và nước ao nuôi tôm ....................................................................................................................... 104 Bảng 4.12: Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thảo dược đối với các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus và V. harveyi phân lập từ ao nuôi tôm (mm) ....................................................................................................................... 105 Bảng 4.13: Tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung thảo dược sau 4 tuần nuôi ...................................................................................... 107 xi Bảng 4.14: Tổng tế bào máu (THC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược sau 2 tuần và 4 tuần.................................... 111 Bảng 4.15: Tổng tế bào không hạt (HC), có hạt (GC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược sau 2 tuần và 4 tuần ..... 111 Bảng 4.16: Tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng sau 8 tuần ............... 123 Bảng 4.17: Tổng tế bào máu (THC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết bàng và bần chua ......................................................... 125 Bảng 4.18: Tổng tế bào không hạt (HC), tế bào có hạt (GC) (x106 tb/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết bàng và bần chua ............. 126 Bảng 4.19: Thành phần hóa học trong chất chiết bàng (T. catappa) và bần chua (S. caseolaris) . .135 xii DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ các nội dung nghiên cứu tổng quát của luận án ...................... 4 Hình 2.1: Bản đồ các nước nuôi tôm thẻ chân trắng ......................................... 7 Hình 2.2: Biểu đồ sản lượng tôm nuôi theo khu vực/nước và xu hướng tăng trưởng đến năm 2021 ......................................................................................... 9 Hình 2.3: Biểu đồ sản lượng tôm nuôi ở các nước thuộc Châu Á và xu hướng tăng trưởng đến năm 2021 ............................................................................... 10 Hình 2.4: Diễn biến diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng vùng ĐBSCL giai đoạn 2008 – 2014 ..................................................................................................... 11 Hình 2.5: Cơ cấu diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng các tỉnh vùng ĐBSCL năm 2014 ................................................................................................................. 11 Hình 2.6: Cơ cấu sản lượng nuôi tôm thẻ chân trắng các tỉnh vùng ĐBSCL năm 2014 ................................................................................................................. 12 Hình 2.7: Diện tích nuôi tôm nước lợ ở các tỉnh ĐBSCL đến năm 2020 và tầm nhìn đến 2030 (ha) ........................................................................................... 12 Hình 2.8: Sản lượng nuôi tôm nước lợ các tỉnh ĐBSCL đến năm 2020, tầm nhìn đến 2030 (tấn) .................................................................................................. 13 Hình 2.9: Kích cỡ tôm thu hoạch ở Châu Á .................................................... 13 Hình 2.10: Bản đồ các quốc gia xuất hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ....... 15 Hình 2.11: Trình tự đầy đủ của plasmid pVA1 gây bệnh AHPND trên tôm .. 16 Hình 2.12: Tôm thẻ chân trắng nhiễm AHPND có màu nhợt nhạt ruột rỗng, gan tụy nhợt nhạt, teo (trái); tôm khỏe có màu sắc bình thường (phải) ................ 17 Hình 2.13: Bản đồ trình tự của plasmid pVHvo liên quan đến AHPND trong V. owensii và sơ đồ nhận dạng trình tự của plasmid pVH ................................... 19 Hình 2.14: Mô hình hệ thống cảm biến quorum sensing của V. harveyi) ....... 22 Hình 2.15: Số lượng bài báo nghiên cứu về việc sử dụng thảo dược, tảo, hay các sản phẩm tự nhiên trong nuôi trồng thủy sản .................................................. 33 Hình 2.16: Số lượng bài báo nghiên cứu về việc sử dụng thảo dược chống lại Vibrio gây bệnh trên tôm ................................................................................. 33 Hình 2.17: Tỉ lệ phần trăm (%) các bộ phận cây được sử dụng nghiên cứu dùng trong nuôi trồng thủy sản ................................................................................. 34 Hình 2.18: Tỉ lệ phần trăm (%) hoạt tính sinh học của các chiết xuất thực vật sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ........................................................................ 36 Hình 2.19: Dung môi phân cực và các hợp chất có độ phân cực tương ứn) ... 46 Hình 2.20: Các bước nghiên cứu sử dụng cây thuốc trong nuôi trồng thuỷ sản ......................................................................................................................... 47 xiii Hình 2.21: Tỷ lệ phần trăm nông dân sử dụng phụ gia thức ăn và chiết xuất thảo dược (mũi tên) trong trại nuôi.......................................................................... 48 Hình 2.22: Cây bàng ........................................................................................ 49 Hình 2.23: Cây lựu .......................................................................................... 52 Hình 2.24: Diệp hạ châu thân đỏ ..................................................................... 54 Hình 2.25: Cây bần ổi ...................................................................................... 55 Hình 2.26: Cây bần chua ................................................................................. 56 Hình 3.1: Địa điểm thực hiện phỏng vấn hộ nuôi tôm ở Cà Mau và Sóc Trăng ......................................................................................................................... 67 Hình 3.2: Sơ đồ thí nghiệm xác định tác động của thảo dược kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm thẻ chân trắng ...................................................... 73 Hình 3.3: Sơ đồ thí nghiệm chế độ bổ sung thảo dược trên tôm thẻ chân trắng ......................................................................................................................... 79 Hình 4.1: Biểu đồ thể hiện phần trăm hộ biết đến thực vật làm thảo dược trong nuôi tôm ........................................................................................................... 88 Hình 4.2: Loài thảo dược được hộ nuôi biết đến trong quá trình khảo sát ...... 89 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với 2 chủng vi khuẩn Vibrio. .. 91 Hình 4.4: Hoạt tính kháng của các loại chiết xuất thảo dược. ......................... 93 Hình 4.5: Các loại thảo dược có hoạt tính kháng V. parahaemolyticus (CM5) và V. harveyi (T2016-04) ..................................................................................... 97 Hình 4.6: Khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5) của chất chiết thảo dược. ........................................................................................................ 98 Hình 4.7: Khuẩn lạc vi khuẩn V. parahaemolyticus (A) trên môi trường ChromAgar Vibrio, (B) trên môi trường TCBS ............................................ 103 Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. .......................................................................................... 103 Hình 4.9: Khuẩn lạc vi khuẩn V. harveyi (A) trên môi trường TCBS, (B) trên môi trường phát quang ................................................................................... 104 Hình 4.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với chủng vi khuẩn V. harveyi. ....................................................................................................................... 104 Hình 4.11: Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn thảo dược sau 4 tuần nuôi. 107 Hình 4.12: Hoạt tính PO (490 nm) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược ở tuần 2 và tuần 4. ...................................................... 113 Hình 4.13: Hoạt tính SOD (U/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết thảo dược ở 2 tuần và 4 tuần. ........................................................ 114 xiv Hình 4.14: Ảnh hưởng của thời gian bổ sung chất chiết đến mức độ biểu hiện của các gen miễn dịch (A) crustin, (B) lysozyme và (C) penaeidin-3a trong máu của tôm thẻ chân trắng. .................................................................................. 116 Hình 4.15: Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng sau 14 ngày cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5). .................................................... 118 Hình 4.16: Tôm thẻ chân trắng thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. ................................... 119 Hình 4.17: Kết quả PCR tái định danh vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5) trong thí nghiệm cảm nhiễm. ......................................................................... 119 Hình 4.18: Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng sau 8 tuần bổ sung chất chiết thảo dược.. ............................................................................................................. 124 Hình 4.19: Hoạt tính PO (490 nm) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết bàng và bần chua.. ......................................................................... 127 Hình 4.20: Hoạt tính SOD (U/mL) của tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung chất chiết bàng và bần chua.. ......................................................................... 128 Hình 4.21: Ảnh hưởng của nhịp bổ sung chất chiết đến mức độ biểu hiện của các gen miễn dịch (A) crustin, (B) lysozyme và (C) penaeidin-3a trong máu của tôm thẻ chân trắng.. ....................................................................................... 130 Hình 4.22: Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng sau 14 ngày cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolitycus (CM5). .................................................... 132 Hình 4.23: Tôm thẻ chân trắng thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. ................................... 133 Hình 4.24: Kết quả PCR tái định danh vi khuẩn V. parahaemolyticus (CM5) trong thí nghiệm cảm nhiễm. ......................................................................... 133 xv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease AHPNS Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome AS Anticoagulant solution C:N Tỷ lệ cacbon và nitơ cDNA Complementary DNA CFU Colony-forming unit CAGR Compound annual growth rate ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long ĐC Đối chứng DHC Differential hemocyte count DNA Deoxyribonucleic acid EMS Early Mortality Syndrome EGCG Epigallocatechin gallate FAO Food & Agriculture Organization of the United Nations FCR Feed Conversion Ratio GOAL Global Outlook for Aquaculture Leadership GPx Glutathione peroxidase GST Glutathione S-transferase HC Hyaline cell H&E Haematoxylin & Eosin HSP70 Heat shock 70kDa protein Ig Immunoglobin Kg Kilogram LC Large granular cell LD50 The 50% lethal dose LPS Lipopolysaccharides MBC Minimum bactericidal concentration MHC Major Histocompatibility Complex MIC Minimum inhibitory concentration NA Nutrient Agar NACA Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific xvi NB Nutrient Broth NOS Nitric oxide synthase OD Optical density OIE World Organisation for Animal Health OECD Organisation for Economic Co-operation Development ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction PG Peptidoglycans PL Postlarvae PO Phenoloxidase ProPO Prophenoloxidase RNA Ribonucleic Acid RPS Relative Percentage Survival SGC Semi-granular cell SOD Superoxide dismutase TCBS Thiosulfate-Citrate Bile Salts THC Total hemocyte count xvii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Ở Việt Nam, theo qui hoạch và định hướng phát triển ngành nuôi tôm nước lợ mặn vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đến 2020 và tầm nhìn 2030 của Bộ Nng nghiệp và Phát triển Nông thôn, tổng diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng theo mô hình nuôi thâm canh đạt 90.000 ha (năm 2020) và tăng lên 100.000 ha (năm 2030), tăng trưởng bình quân 1,06%/năm, qui hoạch nuôi tập trung ở Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Tiền Giang, Long An. Đến năm 2030, tổng sản lượng nuôi tôm nước lợ các tỉnh ven biển vùng ĐBSCL là 900.000 tấn, trong đó sản lượng tôm thẻ chân trắng đạt 450.000 tấn (chiếm 50%). Định hướng phát triển theo hướng hiệu quả, bền vững đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước và chế biến xuất khẩu. Tuy nhiên, việc thâm canh hóa nâng cao năng suất kết hợp với vấn đề thời tiết thay đổi thất thường, đã làm gia tăng tình hình dịch bệnh ở hầu hết các mô hình nuôi tôm thương phẩm. Vi khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi được xác định chủ yếu là do các loài Vibrio spp. Ở trại sản xuất tôm giống, Vibrio harveyi là mầm bệnh vi khuẩn thường gặp, gây bệnh phát sáng trên ấu trùng, hậu ấu trùng tôm. Bệnh phát sáng được ghi nhận gây thiệt hại về kinh tế cho nghề nuôi tôm của nhiều nước trên thế giới như Indonesia (Sunaryanto & Mariam, 1986), Thái Lan (Jiravanichpaisal et al., 1994), Philippines (Baticados et al., 1990; Lavilla- Pitogo et al., 1990), Australia (Pizzutto & Hirst, 1995), Đài Loan (Liu et al., 1996 a; b) và Ecuador (Robertson et al., 1998). Trong ao nuôi thương phẩm, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic necrosis disease - AHPND) được ghi nhận là một trong các bệnh phổ biến trên tôm nuôi vùng ĐBSCL. Từ đầu năm 2022 đến nay, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính xảy ra tại 75 xã của 11 tỉnh, thành phố với tổng diện tích trên 342 ha, tăng 7% (Tổng cục Thủy sản, 2022). AHPND được xác định do Vibrio parahaemolyticus chứa plasmid mang gen độc tố (Photorhabdus insect-related, PirA, PirB) (Tran et al., 2013a; b; Kondo et al., 2014; Han et al., 2015a), gây chết đến 100% đàn tôm. Bệnh xuất hiện trên tôm ở giai đoạn 30 đến 35 ngày nuôi (FAO, 2013; Hong et al., 2016; NACA, 2012), và ở giai đoạn tôm 46 đến 96 ngày nuôi (De la Peña et al., 2015). Ngoài ra, các loài vi khuẩn Vibrio spp. (Vibrio harveyi, V. campbellii, V. punensis và V. owensii) chứa plasmid mang gen độc tố cũng có khả năng gây AHPND (Kondo et al., 2015; Dong et al., 2017; Liu et al., 2018; Restrepo et al., 2018; Xiaosha et al., 2020). Xiao et al. (2017) cho rằng plasmid mang gen 1