Nghiên cứu sự ảnh hưởngcủa malachite green lên sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hoá và tồn lưu trongcá tra (pangasius hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG HẢI TOÀN NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) GIAI ĐOẠN GIỐNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN 2006 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii TÓM TẮT Đề tài ”Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống” được thực hiện từ tháng 03/2006 đến 06/2006 nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của Malachite Green và một số biến đổi sinh hóa trên cá tra. Thí nghiệm gồm hai nồng độ MG gây nhiễm: 0,1mg/l trong 12 giờ và 1mg/l trong 60 phút. Kết quả cho thấy hoạt tính của các men trong não, gan của cá Tra đều bị biến đổi và khả năng phục hồi lại trạng thái bình thường tuỳ thuộc vào nồng độ và thời gian gây nhiễm MG. Sau 60 ngày thí nghiệm MG vẫn còn tồn lưu trên cá tra (2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iii ABSTRACT “Studying the effect of Malachite Green on some biomarkers and residues in the fingerling stages of catfish (Pangasius hypophthalmus) “ was implemented from March to July 2006. The aim of the study was to determine the changes of some biomarkers and the residues of MG on catfish. The experiment included two treatments, 0.1 mg MG/l in 12 hours and 1 mg MG/l in 1 hours, each applied in 3 replicates. The results showed that the biomarkers activity in brain and liver tissues were changed and restored ability depending on the treatment. After 60 days of decontamination, MG still contaminated on catfish (2.01 ± 1.88 ppb and 1.50 ± 2.59 ppb). Keywords: Malachite Green, biomarker, residue. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iv MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH CÁC TỪ VIẾT TẮT CHƯƠNG 1 .................................................................................................. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2 .......................................................................................................... 3 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................................... 3 2.1 Sơ lược về Malachite Green............................................................................. 3 2.1.1 Sơ lược về Malachite Green ....................................................................... 3 2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của Malachite Green................................................................................................. 3 2.1.3 Độc tính của Malachite Green .................................................................... 4 2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green ................................................................. 5 2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite Green trên thế giới........................................ 5 2.2.2 Tính hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam ........................................ 6 2.3 Ảnh hưởng của Malachite Green...................................................................... 6 2.4 Một số nghiên cứu về chỉ tiêu sinh hóa LPO, ACHE, GST, CAT,G6PD ...................................................................... 7 CHƯƠNG 3: ......................................................................................................... 9 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................. 9 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................... 9 3.1.1 Địa điểm .................................................................................................... 9 3.1.2 Thời gian thực hiện .................................................................................... 9 3.2 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 9 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm..................................................................................... 9 3.2.2 Cá thí nghiệm............................................................................................. 9 3.2.3 Bố trí thí nghiện ...................................................................................... 10 3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu............................................................ 10 3.2.5 Chuẩn bị mẫu ........................................................................................... 11 3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu ..................................................................... 11 3.3. Xử lí số liệu .................................................................................................. 16 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu v CHƯƠNG 4 ........................................................................................................ 17 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 17 4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong thời gian gây nhiễm Malachite Green ........................................................................................... 17 4.2 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống ..................................................... 19 4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green .............................. 20 4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green ...................................................................... 21 4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green ........................................................... 22 4.3 Sự biến đổi của các chỉ tiêu sinh hoá trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm................................................................................. 23 4.3.1 Hoạt tính của Acethylcholine (AchE) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ............................................................................... 23 4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ................................................................................ 25 4.3.3 Hoạt tính của men Gutatehion-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ...................................................................... 26 4.3.4 Hoạt tính của men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ..................................... 27 4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ................................................................................ 28 CHƯƠNG 5 ........................................................................................................ 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................ 30 5.1 Kết luận ......................................................................................................... 30 5.2 Đề xuất ......................................................................................................... 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 31 PHỤ LỤC............................................................................................................ 34 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn .................................................................................... 4 Bảng 2: Quá trình phân tích AchE ................................................................. 12 Bảng 3: Cách pha đường chuẩn MDA ........................................................... 13 Bảng 4: Quá trình phân tích GST................................................................... 14 Bảng 5: Quá trình phân tích G6PDH.............................................................. 14 Bảng 6: Quá trình phân tích CAT .................................................................. 15 Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin............................................................... 16 Bảng 8: Nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm MG .......................................... 17 Bảng 9: pH trong quá trình gây nhiễm MG ................................................... 18 Bảng 10: Oxy hoà tan trong quá trình gây nhiễm MG ................................... 18 Bảng 11: Sự tồn lưu MG + LMG theo thời gian thí nghiệm........................... 19 Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm........................................ 21 Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm ..................................... 22 Bảng 14: Biến đổi hoạt tính của AchE trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 23 Bảng 15: Biến đổi hàm lượng của LPO trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ........................................................................ 25 Bảng 16: Biến đổi hoạt tính của GST trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 26 Bảng 17: Biến đổi hoạt tính của G6PD trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 27 Bảng 18: Biến đổi hoạt tính của CAT trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 28 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vii DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Sự tồn lưu MG và LMG theo thời gian thí nghiệm.................................. 20 Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm .................................. 22 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu viii CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long LMG Leucomalachite green MG Malachite Green AchE Acethylcholine LPO lipid peroxidase GST Glutathione S-transferase G6PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase CAT Catalase UBND Ủy ban nhân dân EU Thị trường chung Châu Âu BTS Bộ Thủy Sản HAE 4- hydroxyalkenals MDA malondialdehyde DCP 2,4-dichlorphenol MC-RR micocystin-RR TCA Trichloroacetic acid DMSO Dimethyl sulfoxide TBA Thiobarbituric acid minimum DTNB 5,5 dithiobis 2nitrobenzoic acid CDNB 50 mM 1-chloro 2,4-dinitro benzene GSH Glutathione 50mM G-6-P D-glucose 6 phosphat NADP nicotin amiđe adenine đinucleotide phosphate LOOP lipid hydrerxdes Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 600.000 ha diện tích mặt nước ngọt, là nơi có tiềm năng rất lớn cho việc nuôi các loài cá nước ngọt như: Cá tra, basa, vồ đém, hú, tra bần…trong đó cá tra (Pangasius hypophthalmus) là đối tượng được nuôi chính và truyền thống. Đối tượng này được người nuôi ưa chuộng vì có những ưu điểm như: dễ nuôi, tăng trọng nhanh, kích cở lớn dễ thích nghi với môi trường khắc nghiệt, dễ sử dụng thức ăn, có thể nuôi ở mức độ thâm canh cao. Trong những năm gần đây, do việc quảng bá, thúc đẩy xuất khẩu mặt hàng cá tra của ngành thuỷ sản nên uy tín, số lượng và thị trường của mặt hàng cá Tra Việt Nam được nâng cao rất nhiều. Theo số liệu thống kê của 2 tỉnh An Giang, Cần Thơ năm 2005, tình hình nuôi cá tra ở khu vực đã có bước phát triển đáng kể, sản lượng loài cá này trong khu vực An Giang và Cần Thơ năm 2004 là trên 160.000 tấn (Cục thống kê An Giang và Cục thống kê Cần Thơ, 2005). Từ đó kỹ thuật nuôi phát triển rất nhanh, năng suất sản lượng gia tăng đáng kể, tăng cường nuôi thâm canh, mật độ thả nuôi tăng (120-130 con/m3 trong nuôi bè và 25-35con /m2 trong nuôi ao đất (Nguyễn Chính, 2005). Tuy nhiên vì muốn gia tăng năng suất, sản lượng mà người nuôi đã thả mật độ dày đặc, cho thức ăn thừa dẫn đến môi trường bị ô nhiễm, dịch bệnh thường xảy ra dẫn đến việc sử dụng các loại thuốc, hoá chất trong phòng trị bệnh cho thuỷ sản nuôi là vấn đề cần thiết và hợp lý và được sử dụng nhiều dẫn đến lạm dụng (Nguyễn Thị Phương Nga, 2004). Đặc biệt là thường xuyên sử dụng một số hóa chất cấm sử dụng như là Malachite Green. Chất Malachite Green được dùng rất phổ biến trên thế giới trị các bệnh nấm bên ngoài và kí sinh trùng trong ương nuôi cá và các loài sò hến (nhuyễn thể). Đó là một loại thuốc trị nấm rất công hiệu và thường xuyên dùng để tẩy trùng các bể ương cá giống. Chất Leucomalachite green (LMG) là chất được tạo thành trong quá trình chuyển hóa của Malachite Green và thường tồn dư trong cá một thời gian dài, ngay Malachite Green không còn tồn lưu nữa (CFIA, 2005). Chính vì sự tồn lưu này ảnh hưởng đáng kể đến ngành xuất khẩu thủy sản sang các nước Châu Âu, Mỹ, Canada, Nhật,…Cụ thể là cuối năm 2004 hàng chục container cá da trơn, cá rô phi và cá trê xuất khẩu của các doanh nghiệp An Giang, Đồng Tháp,…bị trả về do phát hiện nhiễm chất Malachite Green (www.vietnam.net, 28/2/2005). Ngoài ra việc sử dụng hoá chất còn ảnh hưởng đến một số biến đổi sinh hoá gây ức chế đến hoạt động sống của cá. Do đó đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống” được thực hiên là rất cần thiết, nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu và Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu họ tập và hiên cứu 2 đào thải của Malachite Green trên cá tra và một số biến đổi sinh hóa. Từ đó đề xuất giải pháp hợp lý để sản xuất sản phẩm có chất lượng và an toàn. Nội dung nghiên cứu: · Ảnh hưởng của sử dụng Malachite Green lên sự biến đổi Acetylcholine, lipid peroxidation, Glutathione S-transferase, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Catalase trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở giai đoạn giống. · Phân tích sự tồn lưu Malachite Green trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở giai đoạn giống. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 SƠ LƯỢC VỀ MALACHITE GREEN 2.1.1 Sơ lược về Malachite green Malachite Green ( MG) có tên hóa học là Triphenylmethane. MG là một loại bột rất mịn có màu xanh được dùng để nhuộm tơ, vải, giấy, da. MG cũng được dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn và bào tử của nó. Từ lâu MG được xem là chất diệt nấm ( loại saprolegnia ssp ) và diệt ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa). MG khác với sulfate đồng copper sulfate (CuS04) mà còn gọi là phèn xanh dùng để diệt ốc, diệt nấm và rong rêu trong nông nghiệp. MG đã được giới nuôi trồng thủy sản trên thế giới sử dụng một cách rộng rãi từ lâu để phòng và trị bệnh cho cá tôm và hến. Tại Canada trước 1992 các trại sản xuất cá giống cũng thường sử dụng MG để ngăn ngừa trứng cá bị nhiễm nấm. Ngày nay Canada cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong đó có Trung Quốc và Việt Nam đều nghiêm cấm việc sử dụng chất MG trong việc nuôi trồng thủy sản. Chloramphenicol, Nitrofurans , xanh Malachite được liệt kê trong danh mục các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản Việt Nam. Tại VN, MG vẫn còn được các hộ nuôi trồng thủy sản sử dụng để vệ sinh ao hồ, tắm cá trước khi thả chúng vào lồng nhằm mục đích ngừa cá bị nhiễm nấm hoặc nhiễm ký sinh trùng. Khi vào cơ thể cá, MG sẽ bị phân hủy ra thành chất chuyển hóa (metabolite) là Leucomalachite Green (LMG). Thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG có thể tồn tại trong 1 thời gian rất lâu dài trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm MG.( www.khoahoc.net,22/12/2005) 2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của Malachite green. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4 Công thức cấu tạo [ __ ] [ / \__N(CH2)2 ] [ __ / \__/ ] _ [ / \__C __ + ] Cl [ \__/ \ / \__N (CH2)2 ] [ \__/ ] [ ] Công thức phân tử : C23H25N2.CL Một số tên thường gọi: · Malachite green chloride · C.i. Basic green 4 · Benzaldehyde green · n-(4-((4-(dimethylamino)phenyl) phenylmethylene)-2,5-cyclohexadiene- 1- ylidene) -n-methyl-chloride · Acryl brilliant green · Aniline green · Aizen malachite green 2.1.3 Độc tính Malachite green. Độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá tôm có thể chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng sẽ dẫn đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng MG vào lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất. Đặc biệt trong các tháng mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống. (Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004). Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn (Ictarulus punctatus) của Bills và ctv (1997) được trình bày ở bảng sau: Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn LC50 (mg/l) pH Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ) 0,4 7,5 22 6 1,72 8 12 6 1,3 8 12 6 0,286 8 12 24 0,238 7,5 22 6 0,519 9,5 12 6 Kết qủa này cho thấy nhiệt độ càng tăng thì độc tính của MG càng tăng. pH càng cao thì độc tính của MG càng cao. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 5 Một nghiên cứu về độc tính của MG và LMG được tiến hành trong thời gian 2 năm của Trung tâm Nghiên cứu Độc tố Quốc gia Hoa kỳ cho thấy MG và LMG làm hại gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay đổi gene (mutagenic) và gây ung thư (carcinogenic) trên loài chuột thí nghiệm. Qua việc thẩm định các kết quả trên, giới khoa học đưa ra kết luận rằng MG và LMG là 2 chất nguy hại có tiềm năng gây ung thư cho người. (Sở Nông Nghiệp An Giang, 2/2/2005). Năm 2002 Canada cũng như nhiều quốc gia khác đã nhận thấy chất Malachite Green có thể là một mối đe dọa cho sức khỏe nên bắt đầu đề ra những chương trình kiểm nghiệm MG ở một số loại cá tôm bán ở thị trường. Các quốc gia trong khối Liên minh Châu Âu và Châu Úc ấn định giới hạn tồn lưu tối đa của MG và LMG trong sản phẩm thủy sản là 2 ng/g (ppb). Hoa kỳ và Canada thì cho áp dụng nguyên tắc zero tolerance, nghĩa là không chấp nhận sự hiện diện của bất kỳ 1 dư lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG. (www.khoahoc.net,22/12/2005). Trước những tác hại có thể gây ra đối với sức khỏe con người và nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm, đáp ứng yêu cầu khắt khe của thị trường xuất khẩu thủy sản, theo chỉ thị của Bộ Thủy Sản 7/3/2005 về việc ngừng sản xuất, tiêu thụ và sử dụng MG trong nuôi trồng thủy sản và đề nghị tất cả các hộ nuôi thủy sản không được sử dụng MG để phòng và trị bệnh cho thủy sản. 2.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG MALACHITE GREEN 2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite green trên thế giới Trong các thập niên vừa qua ngành nuôi trồng thủy sản thế giới đã có những bước tiến bộ vượt bậc. Do việc áp dụng kỹ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm cho thủy sản nuôi chết hàng loạt, đòi hỏi người nuôi phải tìm biện pháp khắc phục, trong đó việc sử dụng thuốc, hóa chất trong việc phòng và trị bệnh là biện pháp hữu hiệu. Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một vài tỉnh vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay MG vẫn được sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như một chất diệt nấm. Nguyên nhân là do loại chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dễ mua. ( www.vietnam.net). Theo Bộ Nghề Cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy trong các trại nuôi cá hồi và cá ché