Luận án Đa dạng di truyền bộ sưu tập giống ca cao (Theobroma cacao L.) Việt Nam và khảo sát chất lượng hạt ca cao tại Đắk Lắk và Bến Tre

iCHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận án này với tựa đề “Đa dạng di truyền bộ sưu tập giống ca cao (Theobroma cacao L.) Việt Nam và khảo sát chất lượng hạt ca cao tại Đắk Lắk và Bến Tre” do nghiên cứu sinh Lâm Thị Việt Hà thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS.TS Trương Trọng Ngôn và GS.TS. Hà Thanh Toàn. Luận án đã báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thông qua ngày /12/2023. Luận án đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại. Thư ký Ủy viên Ủy viên Ủy viên Chủ tịch hội đồng ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn sâu sắc sự giúp đỡ của các Thầy, Cô, đồng nghiệp, bạn bè và thành viên trong gia đình, những người luôn đồng hành với khó khăn mà tôi đã gặp trong suốt chương trình học của một nghiên cứu sinh, cùng với nỗ lực cố gắng của bản thân mình. - Giáo sư, Tiến sĩ Hà Thanh Toàn, Hiệu trưởng trường Đại học Cần Thơ, Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông Nghiệp. Một người Thầy kính mến đã luôn đồng hành từ những ngày em vào làm việc tại Bộ môn Công nghệ Thực phẩm năm 2000. Thầy đã luôn động viên và chỉ bảo em rất nhiều lần em gặp nghiên cứu thất bại và các vấn đề khó khăn trong suốt quá trình học từ năm 2001; Thầy đã gợi ý đề cương cho nghiên cứu này, đã truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình thực hiện đề tài, và nhất là Thầy đã cho em những lời khuyên bổ ích khi gặp bất cứ trở ngại nào trong học tập và gia cảnh. Học trò xin cám ơn Thầy rất nhiều. - Không thể không nói đến lời cám ơn sâu sắc Phó giáo sư, Tiến sĩ Trương Trọng Ngôn; Thầy luôn động viên và chia sẽ những kinh nghiệm rất quý báu, và thường xuyên nhắc nhở em hoàn thành các thí nghiệm và bảo vệ luận văn đúng hạn. Bên cạnh đó, Thầy là người hướng dẫn và cũng là thầy giảng dạy các môn học bổ sung, chuyên đề. Học trò xin cám ơn Thầy. - Thầy Nguyễn Văn Thành, Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, cùng thầy Trần Nhân Dũng; hai Thầy luôn hỗ trợ em trong quá trình thực hiện chuyên đề, tiểu luận, và báo cáo môn học. Và tôi vô cùng cám ơn Ts. Pha, Ths. Liên, Ts. Bích Vân, PGs.Ts. Khang, Pgs.Ts. Phong, anh Tuấn. em Bé Năm, thuộc Viện Công nghệ Sinh Học; em Phùng Thị Hằng, thạc sĩ Khoa Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Các chị, em đã luôn giúp đỡ và hỗ trợ trong quá trình thực hiện các thí nghiệm di truyền và thí nghiệm hình thái thực vật của 63 mẫu giống ca cao Việt Nam. - Cùng đồng nghiệp trong bộ môn, đã động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài; 03 sinh viên Sư Phạm Sinh K41, 14 sinh viên Công Nghệ Thực Phẩm K41, K42, K43 đã giúp tôi thu thập số liệu cho các thí nghiệm về hình thái học, lên men và sấy hạt ca cao tại Đắk Lắk và Bến Tre. - Các thành viên gia đình, chồng và hai con, đã luôn đồng hành trong những giai đoạn khó khăn; không thể quên trong giai đoạn học nhưng ông xã lại mắc bệnh, tôi đã muốn dừng học. Nhiều cản trở tôi đã gặp suốt quá trình học tập; mẹ, bố mẹ chồng, hai em gái đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi. Tôi xin chân thành cám ơn. Nghiên cứu sinh Lâm Thị Việt Hà iii TÓM TẮT Tên đề tài: Đa dạng di truyền bộ sưu tập giống ca cao (Theobroma cacao L.) Việt Nam và khảo sát chất lượng hạt ca cao tại Đắk Lắk và Bến Tre Phân loại các giống cây ca cao trồng tại Việt Nam hiện chưa được công bố và chưa được nghiên cứu tổng thể và chi tiết. Ca cao là loài cây công nghiệp cho giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Đề tài khảo sát di truyền bộ sưu tập gồm sáu mươi ba (63) giống cây ca cao Việt Nam (Theobroma cacao L.) đang trồng tại các địa phương nhằm phân loại hình thái và mối liên hệ đa dạng di truyền giữa các giống cây ca cao đang trồng tại miền Nam Việt Nam. Đa dạng di truyền bộ sưu tập được khảo sát bằng ghi nhận cơ sở dữ liệu hình thái thực vật và thiết lập giản đồ phả hệ bằng phương pháp phân tích di truyền phân tử. Khảo sát đặc tính hình thái thực vật dựa vào các đặc tính hình thái và màu sắc của cơ quan sinh dưỡng (lá) và cơ quan sinh sản (hoa, trái). Kết quả ghi nhận được 05 hình dạng lá đài khác nhau của bộ sưu tập (oval, broad, deltoid, elliptic và sub-lanceolate); 63 giống ca cao Việt Nam biểu hiện 03 dạng trái khác nhau Angoleta, Amelonado và Cundeamor, màu trái và lá non biểu hiện 02 màu nâu đỏ và vàng xanh; trái chín thể hiện hai màu khác nhau, đỏ và xanh. Giống TD11 có cấu trúc 03 cặp bầu noãn khác biệt so với 02 cặp của 62 giống còn lại. Có 03 loại hình thái trái ca cao trong bộ sưu tập bao gồm Angoleta (30 dòng), Amelonado (13 dòng) và Cundeamor (20 dòng). Sáu mươi ba dòng ca cao (giống ca cao) được phân loại thành 03 nhóm theo phân loại hình thái trái ca cao Trinitario-Criollo, Trinitario-Forastero, và Trinitario. Phân loại theo sự khác nhau về màu sắc trái (56 dòng trái vàng và 7 dòng trái đỏ cam). Phân tích di truyền ghi nhận sự khác biệt trong vùng ITS giữa các giống không lớn, phân chia thành ba nhóm bao gồm nhóm Domestic Trinitario Cultivars (38 dòng), Indigenous Cultivars (20 giống), and Peru Cultivars (5 dòng). Kết quả đề tài là công bố đầu tiên về dữ liệu hình thái thực vật và di truyền phả hệ của bộ sưu tập giống cây ca cao Việt Nam. Ngoài ra, lên men và sấy hạt là hai quá trình rất quan trọng của quá trình lên men hạt ca cao. Lên men là quá trình tiền sinh hương của các sản phẩm ca cao. Đề tài khảo sát sự lên men và sấy hạt ca cao của 03 giống sản lượng cao và chất lượng nhất, iv được trồng tại Eukar- Đắk Lắk và Châu Thành - Bến Tre (hai vùng sản lượng hạt ca cao khô cao nhất). Nghiên cứu tiến hành khảo sát sự lên men hạt trong điều kiện có kiểm soát nhiệt độ và thời gian. Nghiên cứu sự thay đổi độ chua - pH, hàm lượng axit, hàm lượng axit béo tự do (FFA) trong quá trình lên men hạt; đồng thời khảo sát điều kiện tối ưu các yếu tố nhiệt độ và thời gian của quá trình sấy hạt sau lên men. Kết quả ghi nhận hạt ca cao đạt chất lượng tốt nhất trong điều kiện lên men nhiệt độ 40oC trong thời gian 6 ngày; pH 5,93; hàm lượng FFAs ở mức thấp 0,30%. Kết quả tối ưu của quá trình lên men được sử dụng cho thí nghiệm sấy hạt tiếp theo. Kết quả nhiệt độ sấy 50oC trong thời gian 21 giờ, hạt ca cao khô đạt giá trị pH 6,15; hàm lượng axit 0,82%, hàm lượng axit béo tự do cho phép 1,08 %. Kết quả đề tài góp phần phục hồi và phát triển ngành nông nghiệp trồng cây ca cao và sản xuất hạt ca cao khô tại hai vùng Tây Nguyên và ĐBSCL -Việt Nam. Từ khóa: ca cao, di truyền phả hệ, trình tự ITS1-4, hình thái thực vật, lên men hạt, sấy hạt vABSTRACT Tittle: Genetic diversity of Vietnamese cocoa cultivars (Theobroma cacao L.) and high-quality investigating of cocoa beans in Đắk Lắk and Bến Tre. In the present, the morphological characteristic of Vietnamese cocoa cultivars have not been conducted and classified yet. Cocoa is crucial industrial resource in terms of nutrient and contributing economic values. This study examined the morphological traits of 63 cocoa cultivars (Theobroma cacao L.) that have been cultivated in cocoa regions in Southern of Vietnam based on individually classify their morphological features (including leaf color, pod color and pod shape, flower) and phylogeny analysis (using ITS1-4 sequences). The Vietnamese cocoa flower showed a diversity of morphological characteristics including five shapes of ligule (oval, broad, deltoid, elliptic and sub-lanceolate) and each stamen also had a bi-lobed anther with the exception of trilobed anther for TD11. Three kinds of fruit shapes were identified, namely Angoleta (30 cultivars), Amelonado (13 cultivars) and Cundeamor (20 cultivars), 63 cultivars were classified into three group of cocoa shape varieties namely Trinitario-Criollo, Trinitario-Forastero, and Trinitario. The results examined the variety colors into yellow (56 cultivars) and red in ripe (7 oranges red). The colour of young leaves was observed as being green and red. Their phylogeny relationships were resulted 03 groups Domestic Trinitario Cultivars (38 accessions), Indigenous Cultivars (20 accessions), and Peru Cultivars (5 accessions). The present study is the first report of biodiversity and phylogenetic relationship of Vietnamese cocoa cultivars. Meanwhile, during cocoa industrial manufacturing, fermentation and drying are crucial to the development of chocolate flavour. The research was carried out among 03 cocoa beans cultivars TD3, TD5 and TD8 (the highest yield beans of two cocoa areas Eukar- Đắk Lắk and Châu Thành - Bến Tre, Vietnam). This study investigated change in temperature and time conditions during cocoa bean fermentation; and the effect of the proximate composition (moisture, pH, axit content, total fatty free FFA, total axit and lipit content, and microbial community as well) during the fermentation vi process. The results showed that the ideal conditions led to considerable quality cocoa bean which include 40°C for the sixth day of fermentation. Moisture, pH, axit composition, FFAs showed the acceptable value of (44,68%; 5,46; 0,16%; 0.30% respectively). The microbial biomass recorded the suitable condition for aroma development during the fermentation. The results of fermentation were recorded for the next drying seed process. The results showed that at optimum conditions (50oC in 21 hours) those scored pH 6.15, 0.82% axitity, FFA in limitation 1.08%. The present work is supported for the “Cocoa cultivation development” and “Quality drying cocoa bean production” of cocoa projects in Vietnam. Keywords: cocoa, genetic relationships, ITS1-4, morphology characteristic, fermentation bean, drying bean vii LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Lâm Thị Việt Hà, là NCS ngành Công nghệ Sinh học, khóa 2018. Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu khoa học thực sự của bản thân tôi được sự hướng dẫn của PGS.TS. Trương Trọng Ngôn/GS.TS. Hà Thanh Toàn. Các thông tin được sử dụng tham khảo trong đề tài luận án được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố rộng rãi và được tôi trích dẫn nguồn gốc rõ ràng ở phần Danh mục Tài liệu tham khảo. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn/luận án này là do chính tôi thực hiện một cách nghiêm túc, trung thực và không trùng lắp với các đề tài khác đã được công bố trước đây. Tôi xin lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảm bảo cho lời cam đoan này. Cần Thơ, ngày tháng năm 2023 Người hướng dẫn Tác giả thực hiện PGS. TS. Trương Trọng Ngôn Lâm Thị Việt Hà Người hướng dẫn phụ GS. TS. Hà Thanh Toàn viii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ii TÓM TẮT............................................................................................................................ iii ABSTRACT.......................................................................................................................... v CAM ĐOAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................................vii MỤC LỤC..........................................................................................................................viii DANH SÁCH BẢNG............................................................................................................x DANH SÁCH HÌNH............................................................................................................xi DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT........................................................................................... xiii Chương 1: GIỚI THIỆU.....................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................................ 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................................ 3 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................................... 3 1.4 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 3 1.5 Ý nghĩa của luận án ......................................................................................................... 4 Ý nghĩa khoa học4 Ý nghĩa thực tế... 4 1.6 Những điểm mới của luận án ...........................................................................................5 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................6 2.1 Tổng quan về cây ca cao ..................................................................................................6 2.1.1 Giới thiệu chung... 6 2.1.2 Đặc tính sinh lý thực vật cây ca cao. 8 2.2 Đặc điểm phân loại các nhóm giống ca cao .................................................................. 10 2.3 Các vùng trồng ca cao tại miền Nam Việt nam ............................................................. 14 2.3.1 Ca cao vùng Tây Nguyên....14 2.3.2 Ca cao vùng đồng bằng Sông Cửu Long.............16 2.4 Các giống ca cao chủ lực của Việt nam .........................................................................17 2.5 Dự án Cây Ca cao tại Việt Nam.18 2.5.1 Ca cao vùng Tây Nguyên19 2.5.2 Ca cao vùng đồng bằng sông cửu long19 2.6 Các giống ca cao sử dụng trong nghiên cứu..21 2.7 Giá trị dinh dưỡng của ca cao và các sản phẩm.............................................................23 2.8 Công dụng của ca cao .................................................................................................... 23 2.9 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.24 2.9.1Trên thế giới..26 2.9.2 Ở Việt Nam..26 2.9.3 Các công bố quốc tế về di truyền quần thể......29 2.10 Hàm lượng axit béo trong hạt ca cao – Gen quy định béo ca cao.. ......................... 29 2.11 Quá trình lên men (ủ) và sấy hạt ca cao ......................................................................29 2.11.1 Các giai đoạn trong quá trình lên men hạt ca cao.29 2.11.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ........................................................... 33 2.11.3 Các phương pháp ủ lên men hạt ............................................................................... 35 2.11.4 Nghiên cứu lên men dịch rỉ hạt ca cao ..................................................................... 36 2.11.5 Quá trình Sấy (phơi) hạt ca cao sau lên men ........................................................... 36 2.12 Các công bố trong và ngoài nước về quá trình lên men...39 2.13 Các kết quả nghiên cứu về quá trình sấy......41 Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................. 42 ix 3.1 Phương tiện nghiên cứu .................................................................................................42 3.1.1 Thời gian và địa điểm..42 3.1.2 Thiết bị, hóa chất và dụng cụ..42 3.2 Phương pháp nghiên cứu42 3.2.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu thực vật... ..43 3.2.2 Phương pháp ly trích DNA..47 3.2.3 Phương pháp PCR...47 3.2.4 Phân tích di truyền phả hệ 48 3.2.5 Phương pháp phân tích hóa lý và vi sinh48 3.3 Phương pháp phân tích và xử lý kết quả.. ..........48 3.3.1 Phân loại hình thái.......... 48 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian khi lên men.50 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian khi sấy....50 3.3.4 Khảo sát dịch rỉ hạt......50 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu...50 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................ 50 4.1Phân loại di truyền theo hình thái....51 4.1.1Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng..51 4.1.2 Đặc điểm cơ quan sinh sản..52 4.2 Xây dựng cây di truyền phả hệ ..............................................................................54 4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men hạt ca cao tại Bến Tre .......................... . 57 4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy hạt ca cao tại Bến Tre....68 4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men hạt ca cao tại Đắk Lắk....70 4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy hạt ca cao tại Đắk Lắk70 4.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men dịch rỉ hạt ca cao.. ..........83 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT............................................................................93 5.1 Kết luận ..........................................................................................................................93 5.2 Đề xuất ...........................................................................................................................94 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................95 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ...112 PHỤ LỤC...113 xDANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Đặc tính của các nhóm ca cao.........................................................10 Bảng 2.2 Đặc tính khác nhau giữa nhóm Criollo - Forastero – Trinitario.....12 Bảng 2.3 Nguồn gốc các giống ca cao Việt Nam...........................................20 Bảng 2.4 Đặc tính các giống ca cao Việt Nam ..............................................21 Bảng 2.5 Năng suất các giống ca cao chủ lực ........................................... 22 Bảng 2.6 Hàm lượng các axit béo của 03 giống thí nghiệm......................23 Bảng 3.1 Kí hiệu 63 giống ca cao và nơi thu thập......................................... 42 Bảng 3.2 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp phân tích.............................47 Bảng 3.3 Phân loại nhóm cacao theo hình thái trái và màu lá non................48 Bảng 4.1 Số lượng lá đài ................................................................................50 Bảng 4.2 Hình dạng trái ca cao.................................................... .54 Bảng 4.3 Màu trái ca cao................................................................................ 54 Bảng 4.4 Hàm lượng béo................................................................................ 55 Bảng 4.5 Thành phần hóa học........................................................................ 58 Bảng 4.6 Sự thay đổi mật số VSV..................................................................65 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến pH....................................... 69 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến giá trị cảm quan..................71 Bảng 4.9 Thành phần hóa học của nguyên liệu..............................................72 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến sự thay đổi pH..........................80 Bảng 4.11 Thành phần hóa học của dịch rỉ hạt.............................................. 82 Bảng 4.12 Nồng độ chất khô.......................................................................... 84 Bảng 4.13 Độ cồn ở 200C...............................................................................85 Bảng 4.14 Ảnh hưởng của mật số VSV đến HL axit.....................................87 Bảng 4.15 Ảnh hưởng của mật số nấm men ................................................. 89 Bảng 4.16 Ảnh hưởng của mật số nấm men đến pH......................................89 Bảng 4.17 Các chỉ tiêu phân tích....................................................................92 Bảng 4.19 Phân tích rượu thành phẩm........................................................... 92 xi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Các vùng sản xuất hạt ca cao và sản lượng trên toàn cầu.................7 Hình 2.2 Sự phân bố các nhóm ca cao trên thế giới.........................................8 Hình 2.3 Cây và trái ca cao...............................................................................8 Hình 2.4 Trái ca cao phát triển từ nhánh.......................................................... 8 Hình 2.5 Hạt ca cao sắp xếp trong vỏ...............................................................8 Hình 2.6 Nhóm ca cao Criollo........................................................................11 Hình 2.7 Nhóm ca cao Forastero.................................................................. ..11 Hình 2.8 Nhóm ca cao Trinitario..