Luận án Khảo sát sự thay đổi tính đề kháng Kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli và thử nghiệm sản phẩm thay thế kháng sinh trong phòng, trị bệnh Escherichia coli trên gà tại tỉnh Đồng Tháp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BẠCH TUẤN KIỆT KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Escherichia coli VÀ THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM THAY THẾ KHÁNG SINH TRONG PHÒNG, TRỊ BỆNH Escherichia coli TRÊN GÀ TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 9 64 01 02 NĂM 2024 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BẠCH TUẤN KIỆT MÃ SỐ NCS: P1018001 KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Escherichia coli VÀ THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM THAY THẾ KHÁNG SINH TRONG PHÒNG, TRỊ BỆNH Escherichia coli TRÊN GÀ TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 9 64 01 02 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS. TS. HỒ THỊ VIỆT THU TS. JUAN JOSE CARRIQUE MAS NĂM 2024 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2019 đến năm 2023 trên đàn gà thả vườn ở tỉnh Đồng Tháp, nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng kháng sinh đến sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn và hiệu quả của một số chế phẩm sinh học trong phòng, trị bệnh E. coli trên gà. Phương pháp khảo sát cắt ngang được thực hiện để điều tra tình hình sử dụng kháng sinh; đánh giá sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn thông qua khảo sát sự hiện diện của các gen đề kháng trong mẫu phân gà và phân chuột bằng phương pháp HT-qPCR. Hai thí nghiệm sử dụng kháng sinh và các chế phẩm sinh học được thực hiện để đánh giá hiệu quả phòng, trị bệnh E. coli trên gà, đồng thời theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli sau khi điều trị. Kết quả điều tra cho thấy có đến 87,5% hộ nuôi gà có sử dụng ít nhất một loại kháng sinh; có hơn 35% sản phẩm đã sử dụng có chứa kháng sinh, tỷ lệ thuốc kháng sinh sử dụng thuộc nhóm đặc biệt quan trọng và khá quan trọng trong điều trị bệnh cho người chiếm hơn 53%. Kết quả khảo sát sự hiện diện của các gen đề kháng kháng sinh cho thấy vi khuẩn ở gà và chuột khảo sát có mang rất nhiều gen đề kháng, trong đó phổ biến nhất là các gen đa kháng, các gen đề kháng với nhóm β-lactam, aminoglycoside và tetracycline. Vi khuẩn trên nhóm gà sử dụng kháng sinh phát hiện được số lượng gen nhiều hơn và kiểu gen phong phú hơn vi khuẩn trên nhóm gà đối chứng. Đáng chú ý là vi khuẩn trên gà còn phát hiện được gen cmr-1 mã hóa sự đề kháng với colistin – kháng sinh được xem là cực kỳ quan trọng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở người. Việc sử dụng kháng sinh doxycycline và một số chế phẩm sinh học như: vắc xin phòng bệnh E. coli, Activo, tỏi tươi... có hiệu quả trong việc phòng, trị bệnh E. coli cho gà. Tuy nhiên, ở nghiệm thức sử dụng doxycycline và cả amoxicillin có tác động làm tăng sự hiện diện của các gen đề kháng và tăng tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Với hiệu quả làm giảm tỷ lệ chết, tăng tỷ lệ điều trị khỏi và giảm sự hiện diện của các gen đề kháng sinh ở vi khuẩn cho thấy vai trò quan trọng của vắc xin và một số chế phẩm sinh học như Activo hay tỏi tươi trong việc phòng, trị bệnh E. coli cho gà và góp phần cải thiện được tình trạng đề kháng kháng sinh. Kết quả nghiên cứu phản ánh tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn trên gà nuôi tại tỉnh Đồng Tháp và khuyến cáo người chăn nuôi cần tuân thủ việc sử dụng hợp lý kháng sinh, ứng dụng các chế phẩm sinh học trong chăn nuôi nhằm hạn chế hiện tượng đề kháng kháng sinh và mang lại hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn cho đàn vật nuôi. Song song đó, cần có biện pháp kiểm soát chuột để ngăn ngừa chuột mang mầm bệnh và lan truyền gen đề kháng kháng sinh cho các loài vật nuôi. Từ khóa: đề kháng, Đồng Tháp, kháng sinh, E. coli, gà, thay đổi i ABSTRACT Escherichia coli (E. coli) is an important and common infectious disease in poultry and causes great damage for poultry production. The study was conducted from 2019 to 2023 on free-range chicken flocks in Dong Thap province to evaluate the impact of antimicrobial use on antimicrobial resistance of bacteria and the effectiveness of some biological products in treating E. coli disease in chickens. The horizontal survey method, using questionnaires, was carried out to adjust the situation of antimicrobial use, and evaluate bacterial antimicrobial resistance by examining the presence of resistance genes in chicken and rat feces samples using the HT-qPCR method. At that edge, two experiments using antibiotics and biological products were conducted to evaluate the effectiveness of preventing and treating E. coli disease in chickens and monitoring the antimicrobial resistance of E. coli bacteria after treatment. Survey results showed that up to 87.5% of chicken-raising households used at least one type of antimicrobial; more than 35% of used products contain antimicrobials; the proportion of antimicrobials belonging to the group of particularly important and quite important in treating diseases for humans is more than 53%. The results of the survey on the presence of antimicrobial resistance genes showed that the bacteria in the chickens and mice surveyed had many resistance genes, the most common of which were multi-drugs resistance genes, resistance genes to the β-lactam, aminoglycosides, and tetracyclines groups. Bacteria in the chickens using antimicrobials detected a larger number of genes and more diverse genotypes than the control group of chickens. In particular, bacteria in chickens using antimicrobials also discovered the cmr-1 gene encoding resistance to colistin - an antimicrobial considered extremely important in the treatment of human infectious diseases. The use of doxycycline and some biological products such as E. coli vaccine, Activo, and fresh garlic... are effective in preventing and treating E. coli disease in chickens. However, using doxycycline or amoxicillin has the effect of increasing the presence of resistance genes and increasing antibiotic resistance of bacteria. With the effectiveness of reducing mortality rate, increasing treatment rate, and reducing the presence of antibiotic resistance genes in bacteria, it shows the important role of vaccination and some biological products such as Activo or fresh garlic to control E. coli disease in chickens and contributing to reducing antimicrobial resistance as well. The study results reflect the antimicrobial resistance status of bacteria in chickens raised in Dong Thap province and encourage farmers to adhere to the reasonable use of antibiotics and the application of biological products in the program. Encourage the limitation of antimicrobial resistance and bring effective treatment of bacterial infections to livestock. According to that, there needs to be measures to control rats from carrying disease and spreading antimicrobial resistance genes to livestock. Key words: antimicrobial resistance, Dong Thap, antibiotic, chicken, change ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án, tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè, các bạn đồng nghiệp và các thành viên trong nhóm nghiên cứu Viparc đã giúp tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời tri ân đến cha mẹ, anh chị, các em trong gia đình thân yêu luôn là chỗ dựa, là động lực thúc đẩy tôi nỗ lực hết mình để hoàn thành quá trình học tập. Cảm ơn vợ thân yêu và các con, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất về thời gian và điều kiện học tập, là chổ dựa tinh thần vững chắc và luôn bên cạnh động viên tôi trong những thời điểm khó khăn nhất. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu và Thầy TS. Juan Jose Carrique Mas đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi không thể nào quên sự ủng hộ và hướng dẫn tận tình của quý thầy, cô Khoa Thú y, Trường Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Trường Nông Nghiệp và Khoa Sau Đại học, đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành tiến trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn và chia sẻ nghiên cứu này đến các bạn, các em sinh viên Khoa Thú y, Trường Nông nghiệp; các anh chị, các bạn nghiên cứu sinh, học viên cao học, đã đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình học tập. Cảm ơn các bạn đồng nghiệp ở Chi cục Chăn nuôi, Thú y và Thủy sản, các Tổ Thú y, Trạm Kiểm dịch và hộ chăn nuôi của tỉnh Đồng Tháp, đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Chăn nuôi, Thú y và Thủy sản, Lãnh đạo Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, nâng cao trình độ chuyên môn; cảm ơn các bạn trong nhóm nghiên cứu Viparc đã không ngừng động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Cuối lời, xin kính chúc tất cả mọi người thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành công! Tôi xin chân thành cảm ơn! Bạch Tuấn Kiệt iii CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận án này với tựa đề là “KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI VÀ THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM THAY THẾ KHÁNG SINH TRONG PHÒNG, TRỊ BỆNH ESCHERICHIA COLI TRÊN GÀ TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP”, do nghiên cứu sinh Bạch Tuấn Kiệt thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS. TS. Hồ Thị Việt Thu. Luận án đã báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thông qua ngày:....../...../...... Luận án đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại. Thư ký Ủy viên (ký tên) (ký tên) Ủy viên Phản biện 3 (ký tên) (ký tên) Phản biện 2 Phản biện 1 (ký tên) (ký tên) Người hướng dẫn Chủ tịch Hội đồng (ký tên) (ký tên) iv LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Bạch Tuấn Kiệt, là nghiên cứu sinh ngành Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi, khóa 2018 – đợt 2. Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu khoa học thực sự của bản thân, được sự hướng dẫn của PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu và TS. Juan Jose Carrique Mas. Các thông tin được sử dụng tham khảo trong luận án được thu thập từ các nguồn đáng tin cậy, đã được kiểm chứng, được công bố rộng rãi và được tôi trích dẫn nguồn gốc rõ ràng ở phần Danh mục Tài liệu tham khảo. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án này là do chính tôi thực hiện một cách nghiêm túc, trung thực và không trùng lắp với các đề tài khác đã được công bố trước đây. Tôi xin lấy danh dự và uy tín của bản thân để đảm bảo cho lời cam đoan này. Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2024 Người hướng dẫn Tác giả thực hiện PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu Bạch Tuấn Kiệt TS. Juan Jose Carrique Mas v MỤC LỤC Trang Tóm tắt .......................................................................................................................... i Abstract ......................................................................................................................... ii Lời cảm ơn ................................................................................................................... iii Chấp thuận của hội đồng ............................................................................................. iv Lời cam đoan ................................................................................................................ v Mục lục ........................................................................................................................ vi Danh sách bảng ............................................................................................................ ix Danh sách hình ............................................................................................................ xi Danh mục từ viết tắt .................................................................................................. xiii Chương 1 Giới thiệu ..................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của luận án ........................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2 Chương 2 Tổng quan tài liệu ........................................................................................ 3 2.1 Vi khuẩn E. coli ...................................................................................................... 3 2.1.1 Lịch sử phát hiện ................................................................................................. 3 2.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy ............................................................. 3 2.1.3 Đặc tính sinh hóa ................................................................................................. 4 2.1.4 Sức đề kháng ....................................................................................................... 5 2.1.5 Dịch tễ học ........................................................................................................... 6 2.2 Đề kháng kháng sinh .............................................................................................. 7 2.3 Phân loại đề kháng kháng sinh ............................................................................... 7 2.3.1 Đề kháng thật ....................................................................................................... 8 2.3.2 Đề kháng giả ........................................................................................................ 8 2.3.3 Đề kháng tự nhiên ................................................................................................ 8 2.3.4 Đề kháng mắc phải .............................................................................................. 8 2.4 Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn ............................................................. 9 2.4.1 Tạo men phân hủy thuốc ................................................................................... 10 2.4.2 Thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn ............................................................ 11 2.4.3 Biến đổi vị trí gắn kết ........................................................................................ 11 2.4.4 Bơm đẩy thuốc kháng sinh ................................................................................ 12 2.5 Tình hình nghiên cứu về đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli trên gà ........ 12 2.5.1 Trên thế giới ...................................................................................................... 12 2.5.2 Ở Việt Nam và tại Đồng Bằng Sông Cửu Long ................................................ 14 2.6 Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của việc sử dụng kháng sinh lên sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli theo thời gian ........................................................... 16 2.7. Một số kết quả nghiên cứu về sự tương đồng đề kháng kháng sinh giữa gà và .. 18 2.8 Giới thiệu về giống gà Nòi lai .............................................................................. 19 2.8.1 Đặc điểm ngoại hình .......................................................................................... 19 2.8.2 Nhu cầu dinh dưỡng của gà ............................................................................... 19 2.8.3 Hệ vi khuẩn đường tiêu hóa của gà ................................................................... 20 2.9 Một số giải pháp thay thế kháng sinh trong chăn nuôi ......................................... 20 2.9.1 Axít hữu cơ ........................................................................................................ 20 2.9.2 Probiotic............................................................................................................. 20 2.9.3 Vắc xin phòng bệnh E. coli cho gia cầm ........................................................... 24 2.9.4 Tinh dầu ............................................................................................................. 25 2.9.5 Tỏi ...................................................................................................................... 29 vi Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu .................................................. 32 3.1 Nội dung, thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................ 32 3.1.1 Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 32 3.1.2 Thời gian nghiên cứu ......................................................................................... 32 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu.......................................................................................... 32 3.2 Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................ 33 3.2.1 Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................ 33 3.2.2 Sinh phẩm và hóa chất ....................................................................................... 33 3.2.3 Vật liệu thí nghiệm ............................................................................................ 33 3.3 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 34 3.4 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 34 3.4.1 Nội dung 1: Điều tra thực trạng tình hình chăn nuôi và sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà tại tỉnh Đồng Tháp ................................................................................ 34 3.4.2 Nội dung 2: Khảo sát việc sử dụng kháng sinh và sự hiện diện của gen đề kháng kháng sinh của vi khuẩn trên gà và trên chuột ........................................................... 34 Số lượng mẫu ở cùng thời điểm ................................................................................. 39 Tổng số gen đề kháng phát hiện được ........................................................................ 39 3.4.3 Nội dung 3: Thử nghiệm một số chế phẩm sinh học trong phòng, trị bệnh E. coli trên gà ......................................................................................................................... 39 3.5 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................... 44 Chương 4 Kết quả thảo luận ....................................................................................... 45 4.1 Tình hình chăn nuôi và sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà .......................... 45 4.1.1 Tình hình chăn nuôi ........................................................................................... 45 4.1.2 Tình hình sử dụng kháng sinh của các hộ chăn nuôi ......................................... 46 4.2 Kết quả phân tích mối tương quan yếu tố ảnh hưởng đến việc sử dụng kháng sinh của người chăn nuôi .................................................................................................... 50 4.3 Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn trên gà và chuột ........................................................................................................................... 52 4.3.1 Kết quả tình hình sử dụng kháng sinh của các đàn gà khảo sát ........................ 52 4.3.2 Kết quả khảo sát sự hiện của các gen đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn trên gà và trên chuột .................................................................................................................... 56 4.4 Kết quả nghiên cứu thử nghiệm kháng sinh và các chế phẩm sinh học phòng, trị bệnh E. coli cho gà 35 ngày tuổi ................................................................................ 76 4.4.1 Ảnh hưởng của kháng sinh và các chế phẩm sinh học lên tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ khỏi bệnh của gà nhiễm E. coli .......................................................................... 76 4.4.2 Ảnh hưởng của kháng sinh và các chế phẩm sinh học lên tăng trọng của gà thí nghiệm ........................................................................................................................ 78 4.4.3 Kích thước đường kính vòng vô khuẩn trung bình của vi khuẩn E. coli trên gà ở các nghiệm thức .......................................................................................................... 80 4.4.4 Tỷ lệ hiện diện của các gen đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli trong các mẫu phân gà thử nghiệm sử dụng kháng sinh và các chế phẩm sinh học để trị bệnh E. coli trên gà 35 ngày tuổi ............................................................................................. 82 4.5 Kết quả nghiên cứu thử nghiệm kháng sinh và các chế phẩm sinh học trị bệnh E. coli cho gà con 15 ngày tuổi .................................................................................. 92 4.5.1 Ảnh hưởng của kháng sinh và các chế phẩm sinh học lên tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết của gà sau khi gây nhiễm E. coli ................................................................................ 92 4.5.2 Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học lên tăng trọng bình quân, hệ số chuyển hóa thức ăn và hiệu quả kinh tế của gà thí nghiệm ............................................................. 94 vii 4.5.3 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli trên gà thí nghiệm đối với amoxcicilin và doxycycline ........................................................................................ 96 4.5.4 Sự hiện diện của các gen đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn E. coli trên gà giữa các nghiệm thức .............................................................................................................. 100 Chương 5 Kết luận và đề nghị .................................................................................. 114 5.1 Kết luận............................................................................................................... 114 5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 115 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Số lượng mẫu phân gà và phân chuột được thu thập 37 3.2 Hỗn hợp xét nghiệm mẫu gộp delta gen 38 3.3 Chu trình nhiệt trong phản ứng HT-qPCR để phát hiện các gen mục tiêu 39 4.1 Tình hình chăn nuôi gà tại các hộ chăn nuôi khảo sát (n=96) 45 4.2 Số lượng sản phẩm kháng sinh sử dụng, thời điểm sử dụng và thời gian ngừng 46 sử dụng trước khi xuất bán (n=96) 4.3 Số lượng sản phẩm sử dụng (n=577) 47 4.4 Kết quả phân nhóm kháng sinh quan trọng trong điều trị bệnh cho người theo 48 Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization - WHO) 4.5 Thông tin của các hộ chăn nuôi trong nghiên cứu 50 4.6 Tình hình sử dụng kháng sinh tại các hộ chăn nuôi khảo sát (n=18) 52 4.7 Kết quả về số kiểu gen đề kháng của vi khuẩn trên gà và trên chuột 56 4.8 Kết quả lũy kế số lượng gen đề kháng trên gà và chuột được phát hiện ở các 58 thời điểm lấy mẫu 4.9 Số lượng gen đề kháng trung bình/mẫu ở vi khuẩn trên gà và trên chuột tương 58 ứng với các thời điểm lấy mẫu 4.10 Sự hiện diện của các gen đề kháng theo nhóm kháng sinh phát hiện ở vi 60 khuẩn trên gà và trên chuột 4.11 Tỷ lệ xuất hiện gen đề kháng với từng nhóm kháng sinh của vi khuẩn trên gà 62 4.12 Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng với từng nhóm kháng sinh của vi khuẩn 65 trên chuột 4.13 Kết quả tỷ lệ gà bệnh, tỷ lệ gà chết và tỷ lệ gà khỏi bệnh ở các nghiệm thức 76 4.14 Kết quả tăng trọng của gà ở các nghiệm thức thí nghiệm (g/con) 78 4.15 Kết quả kích thước đường kính vòng vô khuẩn trung bình của kháng sinh đối 80 với vi khuẩn E. coli trên gà ở các nghiệm thức theo thời gian (mm) 4.16 Tỷ lệ hiện diện của các gen đề kháng đối với kháng sinh amoxicillin 83 4.17 Tỷ lệ hiện diện của các gen đề kháng đối với doxycycline của vi khuẩn E. coli 85 trên gà giữa các nghiệm thức 4.18 Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng với nhóm β-lactam và nhóm Tetracycline 87 của vi khuẩn E. coli trên gà ở các nghiệm thức 4.19 Tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ khỏi bệnh của gà thí nghiệm 92 4.20 Tăng trọng của gà, hệ số chuyển hóa thức ăn và hiệu quả kinh tế giữa các 94 nghiệm thức 4.21 Kích thước đường kính vòng vô khuẩn trung bình (mm) của amoxicillin và 96 doxycyline đối với vi khuẩn E. coli ở các nghiệm thức 4.22 Sự hiện diện của các gen đề kháng với amoxicillin của vi khuẩn E. coli trên 100 gà ở các nghiệm thức ix 4.23 Sự hiện diện của các gen đề kháng với doxycycline của vi khuẩn E. coli trên 104 gà ở các nghiệm thức 4.24 Sự hiện diện của các gen đề kháng với nhóm β-lactam và nhóm tetracycline 108 của vi khuẩn E. coli trên gà ở các nghiệm thức x DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Cơ chế đề kháng kháng sinh 12 3.1 Lấy mẫu phân gà thí nghiệm 36 3.2 Chuột mắc bẫy tại các hộ chăn nuôi gà khảo sát 36 3.3 Chuẩn bị mổ chuột lấy mẫu phân trong trực tràng 37 4.1 Biểu đồ tỷ lệ kháng sinh được sử dụng theo phân nhóm kháng sinh 50 quan trọng trong điều trị bệnh cho con người 4.2 Biểu đồ tương quan kinh nghiệm chăn nuôi và tần suất sử dụng 51 kháng sinh 4.3 Tình hình sử dụng kháng sinh ở các đàn gà khảo sát 55 4.4 Biểu đồ số lượng gen đề kháng trung bình/mẫu của vi khuẩn trên 60 gà và trên chuột tương ứng với các thời điểm lấy mẫu 4.5 Biểu đồ số lượng gen đề kháng của vi khuẩn trên gà và trên chuột 61 theo từng nhóm kháng sinh 4.6 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên gà ở 68 các trại gà sử dụng colistin và oxytetracycline 4.7 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên gà ở 68 các trại gà sử dụng colistin 4.8 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên gà ở 69 các trại gà sử dụng oxytetracycline 4.9 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên gà ở 69 các trại gà sử dụng doxycycline 4.10 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên gà ở 70 các trại gà sử dụng amoxicillin 4.11 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên gà ở 70 các trại gà sử dụng sulfonamide 4.12 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên gà ở 71 các trại gà sử dụng ampicillin 4.13 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên gà ở 71 các trại gà sử dụng tylosin 4.14 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên chuột 73 ở các trại gà sử dụng colistin và oxytetracycline 4.15 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên chuột 73 ở các trại gà sử dụng colistin 4.16 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên chuột 74 ở các trại gà sử dụng oxytetracycline 4.17 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên chuột 74 ở các trại gà sử dụng doxycycline xi 4.18 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên chuột 75 ở các trại gà sử dụng amoxicillin 4.19 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng của vi khuẩn trên chuột 75 ở các trại gà sử dụng ampicillin 4.20 Gà bệnh chết sau khi tiêm vi khuẩn E. coli gây bệnh 77 4.21 Biểu đồ kích thước đường kính vòng vô khuẩn trung bình của 81 doxycycline 30 µg đối với E. coli 4.22 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli bằng phương pháp 91 khuếch tán trên thạch 4.23 Kết quả PCR phát hiện gen blaCTX-M, blaTEM và blaSHV 86 4.24 Kết quả PCR phát hiện gen tetM 86 4.25 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng với nhóm β – lactam của 89 vi khuẩn E. coli trên gà ở các nghiệm thức 4.26 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng nhóm tetracycline của vi 90 khuẩn E. coli trên gà ở các nghiệm thức 4.27 Biểu đồ Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng với nhóm β-lactam và 91 nhóm tetracycline của vi khuẩn E. coli trên gà thí nghiệm 4.28 Biểu đồ Kích thước đường kính vòng vô khuẩn trung bình (mm) 98 của amoxicillin đối với vi khuẩn E. coli theo thời gian 4.29 Kích thước đường kính vòng vô khuẩn trung bình (mm) của 99 doxycycline đối với E. coli đối với theo thời gian 4.30 Kết quả kiểm tra sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli bằng 99 phương pháp khuếch tán trên thạch 4.31 Kết quả PCR phát hiện gen blaCTX-M và blaTEM 103 4.32 Kết quả PCR phát hiện gen blaAmpC 103 4.33 Kết quả PCR phát hiện gen tetB 107 4.34 Kết quả PCR phát hiện gen tetM 107 4.35 Biểu đồ Tỷ lệ hiện diện các gen đề kháng với nhóm β-lactam của 110 E. coli trên gà ở các nghiệm thức 4.36 Biểu đồ Tỷ lệ hiện diện các gen đề kháng với nhóm Tetracycline 111 của E. coli trên gà ở các nghiệm thức 4.37 Biểu đồ Sự hiện diện của các gen đề kháng với nhóm β-lactam và 112 nhóm tetracycline của vi khuẩn E. coli trên gà ở các nghiệm thức xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nguyên nghĩa Nghĩa tiếng Việt AMR Antimicrobial resistance Đề kháng kháng sinh AMU Antimicrobial usage Sử dụng kháng sinh APEC Avian pathogenic Escherichia coli E. coli gây bệnh ở gia cầm BPW Buffered peptone water Nước đệm peptone Môi trường thạch Mueller-Hinton CAMHB Cation -adjusted Mueller-Hinton broth khử ion dương CHROM - Môi trường thạch sinh CCA Chromogenic Coliform agar màu chọn lọc E. coli CDC Centers for Disease Control and Prevention Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh (Hoa Kỳ) CFU Colony-forming unit Đơn vị khuẩn lạc Ci Citrate agar Môi trường thạch citrate CLSI Clinical laboratory standard institute Viện tiêu chuẩn phòng xét nghiệm lâm sàng DHFA Dihydrofolic axít Dihydrofolic axít ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long Đồng bằng sông Cửu Long EFSA European Food Safety Authority Cơ quan An toàn thực phẩm Châu Âu EMB Eosin Methylene Blue Xanh methylene eosin ESBL Extended Spectrum Β-lactamase Sinh men β lactam phổ rộng ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli E. coli tiết độc tố ruột The European Committee on Antimicrobial Ủy ban Châu Âu về thử nghiệm độ EUCAST Susceptibility Testing nhạy của kháng sinh ExPEC Extraintestinal pathogenic Escherichia coli E. coli gây bệnh ngoài đường ruột Food and Agriculture Organization of the FAO Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc United Nations Flavor and Extracts Manufacturers Hiệp hội các nhà sản xuất hương liệu FEMA Association và các chất chiết xuất French agency for food environmental Cơ quan An toàn thực phẩm và an FFEOHS and occupational health and safety toàn sức khỏe nghề nghiệp Pháp I Intermediate Trung gian IQR Interquartile range Khoảng trãi giữa KIA Kligler ‘s Iron Agar Môi trường thạch Kligler MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MC MacConkey Agar Môi trường thạch McConkey MDR Multidrug resistance Đa kháng thuốc MGE Mobile genetic elements Yếu tố di truyền di động xiii Nhóm kháng sinh macrolide- MLSB Macrolide-Lincosamide-Streptogramin B lincosamide-streptogramin B MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MR Methyl red Methyl đỏ OD Optical density Mật độ quang phổ phổ (độ đục) OIE Office International des Epizooties Tổ chức Dịch tễ Thế giới Vi khuẩn Ornithobacterium ORT Ornithobacterium rhinotracheale rhinotracheale PABA Para-amino benzoic axít Para-amino benzoic axít PBP Penicillin Binding Protein Protein kết nối với Penicillin PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm muối phosphate PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase R Resistance Đề kháng S Sensitive Nhạy STEC Shiga toxin-producing Escherichia coli E. coli sinh độc tố shiga TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam Tiêu chuẩn Việt Nam TSA Tryptone Soya Agar Thạch đậu nành TSB Tryptone Soya Broth Canh thịt đậu nành VG Virginiamycin Kháng sinh Virginiamycin VP Voges – Proskauer Thử nghiệm Voges – Proskauer WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới WOAH World Organization Animal Health Tổ chức Thú y thế giới ZB Zinc bacitracin Bacitracin muối kẽm xiv CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1. Tính cấp thiết của luận án Bệnh truyền nhiễm do Escherichia coli (E. coli) là bệnh quan trọng, phổ biến trên gia cầm và gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi (Kikuyasu Nakamura, 2000; Ewers et al., 2003; Nolan et al., 2013). Bệnh làm tăng tỷ lệ chết, giảm năng suất và tăng tỷ lệ gia cầm loại thải (Barnes et al., 2003). Bệnh có thể được điều trị bằng kháng sinh, tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh thiếu thận trọng ở người và vật nuôi có thể dẫn đến sự xuất hiện của vi khuẩn kháng kháng sinh (Helmy et al., 2023). Vi khuẩn E. coli có tính linh hoạt di truyền và khả năng thích ứng nhanh với môi trường nên nó dễ hình thành nhiều cơ chế đề kháng với kháng sinh. E. coli có mặt khắp nơi trong đường tiêu hóa của động vật máu nóng nên được xem là vi khuẩn chỉ thị để theo dõi tình trạng đề kháng kháng sinh ở động vật (bao gồm cả gia cầm) (European Food Safety Authority, 2019; Anjum et al., 2021). Đề kháng kháng sinh được xem là vấn đề nghiêm trọng, đe dọa đến sức khỏe toàn cầu. Theo báo cáo của Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention - CDC), đề kháng kháng sinh là nguyên nhân hàng đầu khiến hơn 25.000 người ở Châu Âu và thậm chí hơn 700.000 người trên thế giới đã chết mỗi năm do nhiễm trùng mà không thể điều trị được bằng kháng sinh, do vi khuẩn kháng thuốc. Các tiên lượng cho biết hậu quả sẽ còn tồi tệ hơn, nếu tình trạng đề kháng kháng sinh vẫn tiến triển như hiện tại thì đến năm 2050, đề kháng kháng sinh sẽ gây ra khoảng 10 triệu ca tử vong mỗi năm, vượt qua cả ung thư - là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới hiện nay (O’Neill, 2014; Kraker et al., 2016). Một số nghiên cứu gần đây về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà ở Việt Nam cho thấy mức độ sử dụng kháng sinh rất cao (lượng kháng sinh sử dụng tính theo đầu gia cầm cao gấp 6 lần so với mức ghi nhận được ở một số nước châu Âu); trong đó có đến 84% kháng sinh được sử dụng để phục vụ cho mục đích phòng bệnh (Carrique Mas et al., 2015). Trong một khảo sát tại tỉnh Tiền Giang cho thấy có đến 72% số trại chăn nuôi sử dụng ít nhất một loại kháng sinh để phòng và điều trị bệnh cho gà. Đặc biệt, một số loại kháng sinh quan trọng trong điều trị bệnh cho con người cũng được dùng trong chăn nuôi (Nguyen Van Cuong et al., 2016). Tại thành phố Hồ Chí Minh, có đến 32,6% cơ sở nuôi gà thịt sử dụng kháng sinh không hợp lý và 44,5% các cơ sở không ngừng sử dụng thuốc kháng sinh trước khi giết thịt đúng theo quy định (Võ Thị Trà An và ctv., 2002). Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý sẽ tạo ra các sản phẩm chăn nuôi không đảm bảo an toàn cho người sử dụng, dễ dẫn đến sự phát sinh và phát triển tính kháng thuốc của vi khuẩn (Asokan & Kasimanickam, 2013). Ngoài ra, một số chủng E. coli lưu trú trên gia cầm còn là nguồn gen tiềm ẩn đề kháng kháng sinh có thể lây truyền sang người (Lutful Kabir, 2010; Kheiri & Akhtari, 2016). 1 Hiện nay, có nhiều giải pháp thay thế kháng sinh như: probiotic, prebiotic, axít hữu cơ, tinh dầu, enzyme, chất kích thích miễn dịch và phytogenic (phytobiotic) bao gồm các loại thảo mộc, tinh dầu thực vật... được bổ sung vào trong thức ăn gia cầm ngày càng phổ biến và đóng vai trò cải thiện lượng ăn vào, tăng hệ số chuyển hóa thức ăn, cải thiện khả năng miễn dịch, cũng như khả năng hấp thu dưỡng chất và khả năng kháng khuẩn,... giúp giảm thiểu tình trạng lạm dụng kháng sinh, đồng thời góp phần mang lại hiệu quả trong điều trị bệnh E. coli và các bệnh nhiễm khuẩn cho gia cầm (Mohamed et al., 2022). Trong hệ tiêu hóa của động vật, các loài vi sinh vật và các chủng vi khuẩn hội sinh thường xuyên bị tác động bởi kháng sinh trong quá trình sản xuất; quần thể vi sinh vật luôn có sự tương tác qua lại với nhau trong hệ thống tiêu hóa. Vì vậy, cơ chế tác động, kiểu gen và kiểu hình đề kháng kháng sinh diễn biến rất phức tạp, không chỉ dựa trên một hoặc một vài chủng vi khuẩn. Sự tương tác của các vi sinh vật và kháng sinh ở động vật còn nhiều vấn đề cần được sáng tỏ do sự đa dạng về liều lượng, đường dùng và dược lực học của từng loại kháng sinh thay đổi tùy theo vật chủ, khiến cho bức tranh về đề kháng kháng sinh trở nên phức tạp hơn (Luo et al., 2019). Các nghiên cứu trước đây thường chỉ khảo sát sự đề kháng của một vài chủng vi khuẩn riêng lẻ, trong khi sự đề kháng kháng sinh ở cấp độ quần thể chưa được nghiên cứu. Ngoài ra, các nghiên cứu về sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn theo thời gian, đặc biệt là E. coli trên các loài vật nuôi, cũng như trên gia cầm còn rất ít. Vấn đề đặt ra là sau thời gian sử dụng kháng sinh hay các sản phẩm thay thế kháng sinh có gây ra sự đề kháng ở vi khuẩn hoặc làm giảm tính đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Khảo sát sự thay đổi tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli và thử nghiệm sản phẩm thay thế kháng sinh trong phòng, trị bệnh Escherichia coli trên gà tại tỉnh Đồng Tháp”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát sự thay đổi tính đề kháng kháng sinh của hệ vi sinh vật đường ruột thông qua sự hiện diện của các gen đề kháng ở vi khuẩn trên gà và chuột, khảo sát hiệu quả của một số chế phẩm sinh học trong phòng, trị bệnh E. coli cho gà cũng như tiềm năng thay thế kháng sinh trong chăn nuôi. 2 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn E. coli 2.1.1 Lịch sử phát hiện Vi khuẩn E. coli được phân lập lần đầu tiên từ phân trẻ em vào năm 1885 bởi nhà khoa học Theodore Escherich (1857-1911), vi khuẩn được xếp loại vào ngành Proteobacteria, lớp Gamma proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia, loài Escherichia coli (Scheutz & Strockbine, 2005). Trên gia cầm, E. coli được Lignieres phân lập lần đầu tiên từ tim, gan và lách của gà chết vào năm 1894. Từ năm 1894 đến năm 1922, bệnh được phát hiện trên gà gô trắng, bồ câu, thiên nga, gà tây, chim cút. Ngoài ra, bệnh nhiễm trùng máu do E. coli trên những gà chết có triệu chứng giống như bệnh tụ huyết trùng đã được báo cáo lần đầu vào năm 1907. (Barnes et al., 2008). Lignieres cho rằng trong những điều kiện nhất định, E. coli thường trú trong ruột rời khỏi ruột trở nên có độc lực và gây bệnh nhiễm trùng máu ở gà đẻ, đặc biệt nếu sức đề kháng của gà bị giảm do đói, khát, lạnh hoặc môi trường chăn nuôi thiếu thông thoáng. Vào năm 1923, E. coli gây bệnh viêm ruột trên gà đã được mô tả và phân lập. Từ năm 1938 đến 1965, E. coli được mô tả và phân lập ở nhiều bệnh tích khác nhau như: bệnh u hạt, viêm túi khí, viêm khớp, viêm da, viêm cuống rốn, viêm mắt, viêm phúc mạc và viêm ống dẫn trứng (Barnes et al., 2008). 2.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn E. coli là một loại trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2-3 μm x 0,6 μm. Trong cơ thể E. coli có hình cầu đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong các môi trường nuôi cấy khác nhau, vi khuẩn dài 4-8 μm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già. Phần lớn E. coli di động do có lông ở xung quanh thân nhưng cũng có một số không di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu khoảng giữa nhạt hơn, có thể hình thành giáp mô khi gặp môi trường dinh dưỡng tốt (Hirsh, 2004). Vi khuẩn E. coli phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí trên môi trường dinh dưỡng ở nhiệt độ 18-44oC, pH từ 7,2-7,4. Vi khuẩn E. coli lên men carbohydrate và thường sinh khí. Thời gian tăng sinh và số lượng E. coli trong thời gian phát triển có liên quan đến nhiệt độ nuôi cấy. Vi khuẩn E. coli phát triển tốt trên các môi trường MacConkey (MC), Eosin Methylene Blue (EMB) hình thành nên các khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt được với các vi khuẩn khác. Trên môi trường MC vi khuẩn E. coli lên men đường lactose sẽ hình thành khuẩn lạc màu đỏ hồng, to, tròn đều, mặt khuẩn lạc hơi lồi, không nhầy, viền gọn được bao quanh vòng đục, kích thước từ 2-3 mm; những vi khuẩn E. coli không lên men đường lactose sẽ hình thành khuẩn lạc có màu nhạt. Trên môi trường EMB khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi bóng, màu tím sẫm, có ánh kim (Barnes et al., 2008). Ngoài ra, vi khuẩn E. coli có thể được nuôi cấy trên môi trường Tryptone Bile X-Glucuronide (TBX) có chứa chất BCIG (5-bromo-4-chloro-3- 3 indolyl-D-glucuronic axít) hay còn gọi với tên khác là X-glucuronide, sự xuất hiện của enzyme β-D-Glucuronidase do E. coli tạo ra sẽ cắt đứt liên kết giữa 5-bromo-4-chloro-3- indolyle (chrompohore) và D-glucuronide. Dưới tác nhân oxy hóa, các phân tử chrompohore phản ứng với nhau tạo thành dichloro-dibromo indigo, chính những phân tử dichloro-dibromo indigo này tạo nên màu xanh lá đặc trưng của khuẩn lạc E. coli (TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001)). 2.1.3 Đặc tính sinh hóa Một số thử nghiệm sinh hóa phổ biến dùng để định danh E. coli được thực hiện như: thử nghiệm Indole (I) dương tính; Methyl Red (MR) dương tính; Voges – Proskauer âm tính (Mion et al., 2016); không sử dụng citrate (Ci); không sinh H2S, di động, lên men đường lactose, glucose, sinh khí trên môi trường Kligler Iron Agar (Mac Faddin, 2000). Thử nghiệm Indol: những vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng phân giải tryptophan trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Indol khi kết hợp với paradimethylamino-benzaldehyd có trong thuốc thử Kovac’s sẽ tạo thành hợp chất muối dimethulammonium có màu đỏ, kết quả phản ứng Indole dương tính. Thử nghiệm MR: các vi khuẩn đường ruột thường có khả năng lên men đường glucose tạo thành axít pyruvic. Axít pyruvic lại tiếp tục chuyển hóa thành nhiều loại axít hữu cơ khác như: axít acetic, axít lactic, axít succinic, làm cho pH của môi trường nuôi cấy vi khuẩn hạ thấp xuống dưới 4,5. Chất chỉ thị MR giúp nhận biết độ pH của môi trường nuôi cấy sau khi vi khuẩn lên men glucose. Khi nhỏ chất chỉ thị MR vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, chất chỉ thị MR vẫn giữ màu đỏ là phản ứng dương tính, chất chỉ thị MR chuyển sang màu vàng là phản ứng âm tính. Thử nghiệm VP (Voges - Proskauer): khác với phản ứng MR do tùy loại enzyme mà vi khuẩn có được nên một số vi khuẩn có khả năng oxy hóa đường glucose tạo thành axít pyruvic, nhưng lại không chuyển hóa axít pyruvic thành axít hữu cơ mà thành hợp chất acetyl methyl carbinol (acetoine). Acetoine trong môi trường kiềm cao sẽ bị oxy hóa thành diacetyl. Diacetyl sinh ra sẽ kết hợp với nhóm guanin của arginin có trong pepton tạo thành phức chất có màu đỏ với thuốc thử α-naphtol và KOH 10% hoặc NaOH 40%. Đây là cơ sở của việc đánh giá kết quả của phản ứng VP dương tính. Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate: Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn Simmons Citrate Agar có chứa hợp chất sodium citrat (Na3C6H5O7), nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng được citrate (là nguồn cacbon duy nhất) sẽ làm thừa ra các gốc Na+ do đó môi trường trở nên kiềm và làm cho màu của chất chỉ thị xanh bromothymol có trong môi trường sẽ chuyển từ xanh lá cây sang màu xanh nước biển (blue). Đây là kết quả thử nghiệm dương tính; nếu môi trường không đổi màu là thử nghiệm âm tính. Thử nghiệm trên môi trường Kligler’s Iron Agar (KIA): Môi trường KIA có chứa đường lactose, glucose, sắt, phenol red, pepton (nguồn carbon/nitrogen) và muối sắt thiosulfate natri. Môi trường KIA có màu đỏ hồng, để thực hiện thử nghiệm cần chuẩn bị các ống thạch nghiêng. Môi trường KIA có thể xảy ra ba trường hợp lên men 4