Luận án Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm colletotrichum spp. trên cây hành lá (allium fistulosum l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN QUỐC THÁI NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP KÍCH KHÁNG BẰNG HÓA CHẤT ĐỐI VỚI BỆNH THÁN THƯ DO NẤM Colletotrichum spp. TRÊN CÂY HÀNH LÁ (Allium fistulosum L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62 62 01 12 NĂM 2024 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN QUỐC THÁI MÃ SỐ NCS: P0316005 NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP KÍCH KHÁNG BẰNG HÓA CHẤT ĐỐI VỚI BỆNH THÁN THƯ DO NẤM Colletotrichum spp. TRÊN CÂY HÀNH LÁ (Allium fistulosum L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62 62 01 12 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS. TS. TRẦN THỊ THU THỦY NĂM 2024 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 8/2018 đến tháng 8/2022 tại Cần Thơ và Vĩnh Long. Nghiên cứu gồm 3 nội dung: (1) Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại một số tỉnh trồng hành lá ở ĐBSCL, đồng thời định danh loài nấm Colletotrichum có khả năng gây bệnh nặng trên hành lá, (2) Xác định loại hóa chất với nồng độ và cách xử lý có khả năng kích kháng bệnh thán thư trên hành lá trong thí nghiệm ở nhà lưới và đánh giá hiệu quả kích kháng của các hóa chất trong điều kiện ngoài đồng, và (3) Khảo sát cơ chế kích kháng của hóa chất triển vọng qua biểu hiện mô học, sinh hóa và gen. Nội dung và kết quả đạt được như sau: - Các chủng nấm gây bệnh thán thư trên cây hành lá được thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp đã được xác định là nấm Colletotrichum thông qua sự quan sát hình thái tản nấm và bào tử, cùng với kiểm tra triệu chứng bệnh và tác nhân gây bệnh theo nguyên tắc Koch. Chủng nấm PH3 thu thập tại xã Phước Hậu, huyện Long Hồ, Vĩnh Long là chủng nấm gây hại nặng nhất trên cây hành lá trong tổng số 20 chủng nấm này khi có tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh cao nhất. Loài nấm này được định danh bằng phương pháp quan sát hình thái và sinh học phân tử, thuộc phức hợp loài Colletotrichum gloeosporioides. - Nghiên cứu về loại hóa chất với nồng độ và cách xử lý có khả năng kích kháng bệnh thán thư trên hành lá gồm 2 nội dung: i) đánh giá khả năng hạn chế bệnh thán thư hành lá bằng 2 phương pháp xử lý là nhúng gốc vào hóa chất hoặc phun hóa chất lên lá và ii) đánh giá khả năng hạn chế bệnh thán thư hành lá và gia tăng năng suất với số lần phun khác nhau. Kết quả cho thấy, khi được xử lý với hai hóa chất CaCl2, SA bằng cách nhúng gốc hoặc phun lá đều giúp giảm tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh thán thư hành lá tương đương nhau và khả năng này thay đổi theo nồng độ áp dụng. Sử dụng CaCl2 200 mM hoặc SA 2 mM giúp giảm tỷ lệ bệnh đến 13 ngày sau lây bệnh (NSLB), giảm chỉ số bệnh đến 11 NSLB, tương đương với CaCl2 300 mM hoặc SA 4 mM và tốt hơn so với CaCl2 100 mM hoặc SA 1 mM. Phun CaCl2 200 mM hoặc SA 2 mM từ 2-4 lần/vụ giúp giảm tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh tốt hơn phun 1 lần/vụ. Ngoài ra, phun 4 lần/vụ giúp giảm bệnh kéo dài đến 42 NSLB. Bên cạnh đó, phun 4 lần SA 2 mM còn cho hiệu quả giảm bệnh cao và gia tăng năng suất. Trong thí nghiệm ở điều kiện đồng ruộng, khảo sát hiệu quả của CaCl2 và SA trong phòng trừ bệnh thán thư, bệnh cháy lá và bệnh chết buội trên cây hành lá gồm 4 nghiệm thức (phun tán lá với CaCl2 200 mM; phun tán lá với SA 2 mM; xử lý theo nông dân là phun hỗn hợp hoạt chất trừ bệnh Bronopol + Metalaxyl + Hexaconazole; đối chứng phun nước), 4 lần nhắc lại, bố trí thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi lô thí nghiệm có diện tích 120 m2 tại huyện Bình Tân và Long Hồ, tỉnh Vĩnh Long. Kỹ thuật chăm sóc và phòng ngừa sâu hại được thực hiện như nhau giữa các nghiệm thức. Kết quả cho thấy, phun CaCl2 200 mM hoặc SA 2 mM định kỳ 10 ngày/lần, i bắt đầu từ 15 ngày sau trồng có hiệu quả khá tốt trong việc hạn chế bệnh thán thư, cháy bìa lá và chết buội hành lá. Đối với bệnh thán thư, phun các loại hóa chất này làm giảm tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau lần phun đầu tiên. Hiệu quả giảm bệnh trung bình đạt tương ứng từ 53,7 - 57,1% tại huyện Bình Tân và 45,7 - 65,2% ở huyện Long Hồ. Bên cạnh đó, tỷ lệ bệnh cháy lá, chết buội cũng thấp hơn đối chứng sau 1 đến 2 lần phun. Đồng thời, khi phun chất kích kháng, năng suất thực tế đạt được từ 18,9-21,8 tấn/ha, năng suất thương phẩm đạt 15,0-18,7 tấn/ha và tỷ lệ thương phẩm đạt 79,4-85,8%, cao hơn so với đối chứng (lần lượt 16,8-17,6 tấn/ha; 11,9-13,1 tấn/ha và 70,7-74,7%). - Xử lý CaCl2 200mM hoặc SA 2mM giúp làm gia tăng phản ứng phát sáng của tế bào và sự tích tụ polyphenol trên cây hành lá, làm gia tăng hoạt tính của các enzyme peroxidase, catalase, β-1,3-glucanase và chitinase ở giai đoạn sớm sau nhiễm bệnh. Ngoài ra xử lý SA 2mM còn làm gia tăng hoạt động của gen tổng hợp chitinase ở thời điểm 6, 9 và 36 giờ sau lây bệnh (GSLB), trong khi CaCl2 thể hiện vượt trội ở thời điểm 12 GSLB. Từ khóa: bệnh thán thư, calcium chloride, Colletotrichum gloeosporioides, hành lá, salicylic acid ii SUMMARY The study was carried out from August 2018 to August 2022 in Can Tho and Vinh Long provinces. The study consisted 3 contents: (1) Collection, isolation, and assessment of pathogenicity of scallion anthracnose strains collected in some provinces in the Mekong Delta, and identification of Colletotrichum species of causing severe index on scallion leaves, (2) Determination of induced chemicals with concentrations and treatments capable of managing anthracnose resistance on scallions in net house conditions; and evaluation of the resistance efficacy of induced chemicals in field conditions; and (3) Investigation of resistance mechanism of effective chemicals through histological expression, biochemistry, and gen expression. The results were as follows: - The fungal strains causing anthracnose on scallion collected in Vinh Long and Dong Thap provinces were identified as Colletotrichum fungi through observing the morphology of fungal colonies and spores, along with examining disease symptoms and pathogene according to Koch's postulate. The PH3 strain collected in Phuoc Hau commune, Long Ho district, Vinh Long province was the most aggressive one on scallion plant out of total of 20 anthracnose strains collected in Dong Thap and Vinh Long provinces through a high disease index and disease severity. Beside, using the morphological observation methods and molecular biology, PH3 was identified as Colletotrichum gloeosporioides complex. - The study to determine the concentration, method of treatment, and number of sprays of calcium chloride (CaCl2) or salicylic acid (SA) in the management of anthracnose disease on scallions was performed in two parts, including i) to assess the ability on decreasing the anthracnose disease using 2 treatment methods: stem dipping or foliar spray with CaCl2 and SA and ii) to assess the ability on decreasing anthracnose disease and increase yield using different spraying times of above- mentioned chemicals. The results showed that after treating with CaCl2 and SA both stem dipping and foliar spray decreased anthracnose index and anthracnose severity similarly, and their efficacy depended on different concentrations. Applying CaCl2 200 mM or SA 2 mM reduced the disease index till 13 days after inoculation (DAI) and reduced the disease severity till 11 DAI, equivalent to CaCl2 300 mM or SA 4 mM and better than CaCl2 100 mM or SA 1 mM. Spraying CaCl2 200 mM or SA 2 mM on the scallion plants from 2 to 4 times reduced the disease index and disease severity better than once spraying treatment. Moreover, four sprays reduced the disease by up to 42 DAI. Besides, four sprays with SA 2 mM showed high disease reduction and increased yield. In the experiment in field conditions, the study to assess efficacy of CaCl2 and SA on controlling anthracnose, bacterial leaf blight and stem death diseases on scallion was carried out using four treatments (foliar sprays by CaCl2 200 mM; foliar sprays by SA 2 mM; a positive control as Bronopol + Metalaxyl + Hexaconazole and a negative control), 4 repetitions, arranged iii in a randomized complete block design, each experimental plot was 120 m2, in two districts Binh Tan and Long Ho, Vinh Long province. Insects management and planting techniques were the same between treatments. The results showed that foliar sprays by CaCl2 200 mM or SA 2 mM at every 10 days, starting from 15 days after planting, was effective on reducing disease severities of anthracnose, bacterial leaf blight and stem death. For anthracnose, spraying these chemicals reduced disease index and disease severity after the first spray. The average reductions of the disease were 53.7-57.1% in Binh Tan district; and 45.7 – 65.2% in Long Ho district. Besides, the disease indexes of leaf blight and stem death were lower than those of the negative control after 1 to 2 spray times. Moreover, when spraying CaCl2 200 mM or SA 2 mM, the actual yield from 18.9- 21.8 tons/ha, the commercial yield reaches 15.0-18.7 tons/ha, and the marketability rate 79.4-85.8%, higher than the control (16.8-17.6 tons/ha; 11.9-13.1 tons/ha and 70.7- 74.7%, respectively). - Treatments of CaCl2 200 mM or SA 2 mM increased fluorescence response of host cells and polyphenol accumulation, as well as activities of peroxidase, catalase, β-1,3- glucanase and chitinase at the early stage after pathogen infection. Moreover, treatment of SA 2 mM also up-regulated gen of chitinase at 6, 9, and 36 hours after inoculation (HAI); meanwhile, treatment of CaCl2 200 mM highly expressed at 12 HAI. Keywords: anthracnose disease, calcium chloride, Colletotrichum gloeosporioides, salicylic acid, scallion. iv MỤC LỤC TÓM TẮT .................................................................................................................... i SUMMARY .............................................................................................................. iii LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. v TRANG CAM ĐOAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................... vi DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................. x DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... xvi CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 1.1 Tính cấp thiết của luận án .................................................................................. 1 1.2 Mục đích nghiên cứu ......................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu.......................................................................................... 2 1.4 Tính mới của luận án ......................................................................................... 2 1.5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................... 3 1.5.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 3 1.5.2 Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................ 3 1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................ 3 1.6.1 Ý nghĩa khoa học ............................................................................................ 3 1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................ 3 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 4 2.1 Sơ lược chung về cây hành lá............................................................................. 4 2.1.1 Nguồn gốc ...................................................................................................... 4 2.1.2 Đặc tính thực vật ............................................................................................. 4 2.1.3 Giống .............................................................................................................. 4 2.1.4 Kỹ thuật trồng hành lá..................................................................................... 5 2.2 Bệnh thán thư trên hành lá ................................................................................. 7 2.2.1 Phổ ký chủ, tình hình phân bố và gây hại ........................................................ 7 2.2.2 Triệu chứng bệnh thán thư .............................................................................. 8 2.2.3 Tác nhân gây bệnh .......................................................................................... 9 2.2.4 Sự xâm nhiễm, đặc điểm phát sinh và phát triển của bệnh ............................. 13 2.3 Kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng ........................................................ 18 2.3.1 Định nghĩa .................................................................................................... 19 2.3.2 Các hình thức kích kháng .............................................................................. 19 2.3.3 Dẫn truyền tín hiệu trong miễn dịch thực vật ................................................ 21 2.3.4 Tác nhân kích thích tính kháng ..................................................................... 25 2.3.5 Cơ chế của hiện tượng kích kháng lưu dẫn .................................................... 27 vii 2.3.6 Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kích kháng ................................................... 32 2.3.7 Chi phí thích nghi của tính kháng.................................................................. 32 2.3.8 Một số kết quả nghiên cứu về sử dụng SA và CaCl2 kích kháng bệnh do nấm gây ra trên cây trồng .............................................................................................. 33 2.4 Định danh nấm Colletotrichum gây bệnh trên cây trồng ............................... 35 2.5 Hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm .......................................................... 36 2.5.1 Calcium chloride ........................................................................................... 36 2.5.2 Salicylic acid ................................................................................................ 37 2.5.3 Hoạt chất Metalaxyl ...................................................................................... 38 CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................ 41 3.1 Thời gian và địa điểm ...................................................................................... 41 3.2 Vật liệu, đối tượng, dụng cụ thí nghiệm ........................................................... 41 3.3 Phương pháp thí nghiệm .................................................................................. 42 3.3.1 Nội dung 1. Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp; đồng thời định danh loài nấm này. ......................................................................................... 42 3.3.2 Nội dung 2. Nghiên cứu khả năng kích kháng và kỹ thuật sử dụng hoá chất CaCl2 và SA như một chất kích kháng để hạn chế nấm Collectotrichum gây bệnh thán thư hại hành. .................................................................................................. 46 3.3.3 Nội dung 3. Khảo sát cơ chế kích kháng của CaCl2 và SA thông qua biểu hiện mô học, sinh hoá và gen. ....................................................................................... 50 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 56 4.1. Nội dung 1. Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp; đồng thời định danh loài nấm này. ......................................................................................... 56 4.1.1 Thu thập và phân lập các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp. ..................................................................................... 56 4.1.2 Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp .......................................................................... 58 4.1.3 Kết quả định danh loài nấm Colletotrichum có khả năng gây bệnh nặng trên hành lá ................................................................................................................... 60 4.2 Nội dung 2. Kết quả về nghiên cứu khả năng kích kháng và kỹ thuật sử dụng hoá chất CaCl2 và SA như một chất kích kháng để hạn chế nấm Collectotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư hại hành. .......................................................... 63 4.2.1 Kết quả về ảnh hưởng của các chất kích kháng đến sự sinh trưởng của nấm Colletotrichum gloeosporioides. ............................................................................ 63 4.2.2 Kết quả nghiên cứu hiệu quả hạn chế bệnh thán thư khi sử dụng CaCl2 và SA ở các nồng độ và phương pháp xử lý khác nhau. .................................................... 64 4.2.3 Hiệu quả hạn chế bệnh thán thư và gia tăng năng suất khi sử dụng CaCl2 và SA với các tần suất khác nhau ở điều kiện nhà lưới. .............................................. 66 viii 4.2.4 Hiệu quả quản lý bệnh thán thư và một số bệnh hại chính khác trên cây hành lá của calcium chloride hoặc salicylic acid ở điều kiện ngoài đồng. ....................... 69 4.2.4.1 Hiệu quả của các chất kích kháng đối với các bệnh chính trên cây hành lá tại Bình Tân, Vĩnh Long ............................................................................................. 69 4.2.4.2. Hiệu quả của các chất kích kháng đối với các bệnh chính trên cây hành lá tại Long Hồ, Vĩnh Long......................................................................................... 71 4.2.4.3. Hiệu quả gia tăng năng suất ...................................................................... 73 4.3 Nội dung 3. Kết quả về khảo sát cơ chế kích kháng của CaCl2 và SA .............. 75 4.3.1 Khảo sát phản ứng phát sáng của tế bào ký chủ khi được xử lý với CaCl2 và SA ......................................................................................................................... 75 4.3.2 Khảo sát phản ứng tế bào hành lá thông qua sự tổng hợp polyphenol ............ 81 4.3.3 Sự gia tăng hoạt tính enzyme chitinases, β-1,3-glucanase, catalase và peroxidase trong sự kích kháng.............................................................................. 86 4.3.4 Sự biểu hiện gen tổng hợp enzyme chitinase trong cây hành lá ..................... 96 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 101 5.1 Kết luận ......................................................................................................... 101 5.2 Đề nghị .......................................................................................................... 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 102 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ PHỤ CHƯƠNG ix DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Các bệnh hại do nấm phổ biến trên hành (Burgess et al., 2009) 6 2.2 Một số loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây họ hành 10 (Kim et al., 2008; Dutta et al. (2022)) 2.3 Hình thức sống của các loài nấm Colletotrichum trên các cây ký chủ khác 15 nhau (nguồn: De Silva et al., 2017) 2.4 Tổng hợp các giai đoạn xâm nhiễm của C. gloeosporioides trên lá hành tây 17 (Panday et al., 2012) 2.5 Các loại PR protein liên quan sự kháng bệnh hại do nấm trên cây trồng 21 (Vidhyasekaran, 2018) 3.1 Các chủng nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây hành lá được 43 thu thập tại tỉnh Vĩnh Long và Đồng Tháp. 3.2 Điều kiện khí hậu tại khu vực Bình Tân, Vĩnh Long, tháng 9-11/2020 48 3.3 Điều kiện khí hậu tại khu vực Long Hồ, Vĩnh Long, tháng 01-03/2021. 49 3.4 Các ống nghiệm và hóa chất dùng trong đường chuẩn 52 3.5 Trình tự các primer được sử dụng (Chandrashekar et al., 2015) 55 4.1 Tỷ lệ bệnh thán thư (%) khi lây nhiễm 20 chủng nấm Colletotrichum sp. trên 58 hành lá tại thời điểm 5, 7, 9, 11 và 13 NSLB 4.2 Chỉ số bệnh thán thư (%) khi lây nhiễm 20 chủng nấm Colletotrichum sp. 60 trên hành lá tại thời điểm 5, 7, 9, 11 và 13 NSLB. 4.3 Trung bình bán kính vòng tròn kháng nấm (mm) của các chất kích kháng đối 64 với Colletotrichum gloeosporioides tại thời điểm nấm phát triển đến khoanh giấy đối chứng ở thời điểm 4 ngày sau cấy (NSC) 4.4 Tỷ lệ bệnh thán thư (%) trên hành lá sau khi xử lý CaCl2 và SA trong điều 65 kiện nhà lưới, 2020. 4.5 Chỉ số bệnh thán thư (%) trên hành lá sau khi xử lý CaCl2 và SA trong điều 65 kiện nhà lưới, 2020 4.6 Hiệu quả giảm bệnh thán thư (%) trên hành lá sau khi xử lý CaCl2 và SA 66 trong điều kiện nhà lưới, 2020. 4.7 Tỷ lệ bệnh thán thư (%) khi phun các chất CaCl2 và SA lên cây hành lá trong 66 điều kiện nhà lưới, 2020-2021. 4.8 Chỉ số bệnh thán thư (%) khi phun các chất CaCl2 và SA lên cây hành lá 67 trong điều kiện nhà lưới, 2020-2021. 4.9 Hiệu quả giảm bệnh (%) thán thư sau khi phun CaCl2 và SA lên cây hành lá 67 trong điều kiện nhà lưới, 2020-2021. 4.10 Tỷ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%) thán thư khi thay đổi số lần phun các chất 68 CaCl2 và SA lên cây hành lá trong điều kiện nhà lưới, 2020 – 2021. 4.11 Hiệu quả giảm bệnh (%) thán thư khi thay đổi số lần phun các chất CaCl2 và 68 SA lên cây hành lá trong điều kiện nhà lưới, 2020 – 2021. x Bảng Tên bảng Trang 4.12 Năng suất hành lá (g/chậu) theo số lần phun chất CaCl2 và SA trong điều 69 kiện nhà lưới, 2021. 4.13 Tỷ lệ bệnh thán thư (%) khi phun chất kích kháng ở các thời điểm 15-55 70 NST tại Bình Tân, Vĩnh Long 4.14 Chỉ số bệnh thán thư (%) khi phun chất kích kháng tại các thời điểm 15-55 70 NST tại Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long 4.15 Hiệu quả giảm bệnh (%) thán thư khi phun chất kích kháng tại các thời điểm 70 15-55 NST tại Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long 4.16 Tỷ lệ bệnh cháy lá (%) khi phun chất kích kháng ở các thời điểm 15-55 NST 71 tại Bình Tân, Vĩnh Long 4.17 Tỷ lệ bệnh chết buội hành lá (%) khi phun chất kích kháng ở các thời điểm 71 15-55 NST tại Bình Tân, Vĩnh Long 4.18 Tỷ lệ bệnh thán thư (%) khi phun chất kích kháng ở các thời điểm 15-55 72 NST tại Long Hồ, Vĩnh Long 4.19 Chỉ số bệnh (%) thán thư khi phun chất kích kháng tại các thời điểm 15-55 72 NST tại Long Hồ, Vĩnh Long 4.20 Hiệu quả giảm bệnh (%) thán thư khi phun chất kích kháng tại các thời điểm 72 15-55 NST tại Long Hồ, Vĩnh Long 4.21 Tỷ lệ bệnh cháy lá (%) khi phun chất kích kháng ở các thời điểm 15-55 NST 73 tại Long Hồ, Vĩnh Long 4.22 Tỷ lệ bệnh chết buội hành lá (%) khi phun chất kích kháng ở các thời điểm 73 15-55 NST tại Long Hồ, Vĩnh Long 4.23 Năng suất hành lá (tấn/ha) khi phun chất kích kháng tại Bình Tân và Long 74 Hồ, tỉnh Vĩnh Long 4.24 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichum 76 gloeosporioides tại thời điểm 24 GSLB 4.25 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichum 76 gloeosporioides tại thời điểm 36 GSLB. 4.26 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichum 76 gloeosporioides tại thời điểm 48 GSLB. 4.27 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichum 77 gloeosporioides tại thời điểm 72 GSLB 4.28 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichum 78 gloeosporioides tại thời điểm 96 GSLB 4.29 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichum 79 gloeosporioides tại thời điểm 120 GSLB 4.30 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichum 79 gloeosporioides tại thời điểm 144 GSLB 4.31 Phần trăm (%) đĩa áp của nấm Colletotrichum gloeosporioides tạo sự tổng 82 hợp polyphenol trong tế bào lá hành. xi Bảng Tên bảng Trang 4.32 Diện tích (µm2) vùng polyphenol được tổng hợp/đĩa áp của nấm 83 Colletotrichum gloeosporioides 4.33 Phần trăm (%) đĩa áp của nấm Colletotrichum gloeosporioides tạo sự tổng 83 hợp polyphenol trong tế bào ở mức ++. xii DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Một số bệnh phổ biến trên cây hành lá: (a) cháy lá do vi khuẩn 7 (Xanthomonas axonopodis pv. allii), (b) chết buội (Erwinia sp.) và thán thư (Colletotrichum spp.) 2.2 Triệu chứng bệnh thán thư trên hành lá 8 2.3 Triệu chứng thường gặp trên cây hành do C. gloeosporioides gây ra. a, tổn 9 thương màu trắng với các khối giống như chấm màu cam ở giữa. b, các khối màu cam xếp thành các vòng đồng tâm. c, triệu chứng thán thư điển hình (Perez & Alberto, 2020) 2.4 Đặc tính hình thái của nấm C. circinan phân lập từ vết bệnh ở lá hành A. 11 khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường PDA ở 20 ngày sau cấy, 240C. B. Gai nhọn ở vết bệnh. C. Bào tử. D. Đĩa áp (Kim et al. , 2008). 2.5 Hình thái nấm C. spaethianum; A. Tản nấm C. spaethianum trên môi trường 12 PDA ở 10 NSC. B. bào tử C-D. triệu chứng thán thư trên lá hành. E. Đĩa đài. F. Gai cứng. G-I. Đĩa áp. (Santana et al., 2015) 2.6 Nấm C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. trên môi trường SNA. A. 12 cành bào đài; b. bào tử; c-d. đĩa áp. Thước đo b-c = 10 µm (Liu et al., 2013) 2.7 Nấm C. truncatum (A-D). A, khuẩn lạc trên môi trường PDA ở 10 ngày sau 13 cấy. B, bào tử. C, đĩa đài và gai cứng. D, đĩa áp. Nấm C. theobromicola (E- I). E, khuẩn lạc trên môi trường PDA ở 10 ngày sau cấy. F, bào tử. G, đĩa đài và gai cứng. H-I, đĩa áp. Triệu chứng bệnh thán thư trên cây hành lá được chủng bệnh với C. truncatum (J) và C. theobromicola (K). L, cây đối chứng (khỏe). (Matos et al., 2017). 2.8 Chu kỳ bệnh của nấm C. gloeosporiodes trên cây hành (Allium cepa) 14 (Salunkhe et al., 2022). 2.9 Sự xâm nhiễm của C. gloeosporioides lên lá hành tây được quan sát dưới 16 kính hiển vi điện tử tại thời điểm 6 đến 24 giờ sau xâm nhiễm (Panday et al., 2012) 2.10 Sự xâm nhiễm của C. gloeosporioides lên lá hành tây được quan sát dưới 16 kính hiển vi điện tử tại thời điểm 48 giờ sau xâm nhiễm (Panday et al., 2012) 2.11 Sự xâm nhiễm của C. gloeosporioides lên lá hành tây được quan sát dưới 17 kính hiển vi điện tử tại thời điểm 72 giờ sau xâm nhiễm (Panday et al., 2012) 2.12 Vai trò SA và NPR1 trong dẫn truyền tính kháng (Hà Viết Cường, 2011). 22 2.13 Dòng thác ion (ion fluxes) trong dẫn truyền tín hiệu miễn dịch thực vật (Hà 24 Viết Cường, 2011). 2.14 Đường dẫn truyền tín hiệu MAPK (Hà Viết Cường, 2011). 25 4.1 Triệu chứng bệnh thán thư trên bông hành (a) và trên lá hành (b) thu tại 56 ruộng hành lá ở huyện Bình Tân, Vĩnh Long vào tháng 9/2017. 4.2 Hình thái tản nấm của các chủng Colletotrichum spp. phân lập từ mẫu bệnh 57 thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp xiii Hình Tên hình Trang 4.3 Triệu chứng bệnh thán thư do 3 chủng nấm Colletotrichum sp. gây hại nặng 59 trên cây hành lá; (a) chủng BTVL7, (b) chủng PH2, (c) chủng PH3 so với (d) cây đối chứng 4.4 Đĩa áp và đơn bào tử của chủng nấm Colletotrichum PH3, a: đĩa đài, b: bào 61 tử, c: khuẩn ty nấm phát triển trên môi trường PDA, d: đĩa áp tạo nên trên môi trường PCA. 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu nấm phân lập từ mẫu bệnh thán thư trên 62 cây hành lá tại Long Hồ, Vĩnh Long: (1): mẫu chuẩn, (2): mẫu PH3.1, (3): mẫu PH3.2 4.6 Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor - Joining của chủng nấm 63 PH3.1 và PH3.2 phân lập với 3 chủng C. gloeosporioides khác nhau, 1 loài C. tropicale, 1 loài C. siamense và 1 loài Glomerella cingulata trên GenBank NCBI 4.7 Sự phát triển của nấm C. gloeosporioides về phía khoanh giấy có thấm chất 64 kích kháng ở thời điểm 4 NSC: a-c: lần lượt CaCl2 100mM, CaCl2 200 mM, CaCl2 300 mM; d-f: lần lượt SA 1 mM, SA 2 mM, SA 4 mM và g: đối chứng (nước cất thanh trùng). 4.8 Sự phát sáng tế bào (a), phát sáng tế bào thịt lá (b) ở thời điểm 48 GSLB và 77 phát sáng tế bào mức ++ 4.9 Sự tổng hợp polyphenol ở thời điểm 48 GSLB (a) và tổng hợp polyphenol 82 mức ++ (b). 4.10 Động thái thay đổi hoạt tính enzyme chitinase trong lá hành có phun chất 86 kích kháng và đối chứng có lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides tại các thời điểm từ 0 đến 78 giờ 4.11 Động thái thay đổi hoạt tính enzyme chitinase trong lá hành có phun chất 87 kích kháng và đối chứng không lây bệnh tại các thời điểm từ 0 đến 78 giờ 4.12 Động thái thay đổi hoạt tính enzyme chitinase trong lá hành có phun chất 87 kích kháng có hoặc không lây bệnh tại các thời điểm từ 0 đến 78 giờ 4.13 Tỷ lệ gia tăng hoạt tính chitinase của nghiệm thức có kích kháng đối với đối 88 chứng khỏe tại các thời điểm từ 0 giờ đến 78 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.14 Tỷ lệ gia tăng hoạt tính chitinase của nghiệm thức có kích kháng đối với đối 88 chứng có lây bệnh tại các thời điểm từ 0 giờ đến 78 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.15 Động thái thay đổi hoạt tính enzyme -1,3-glucanase trong lá hành tại các 89 thời điểm từ 0 đến 96 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.16 Tỷ lệ gia tăng hoạt tính -1,3-glucanase của nghiệm thức có kích kháng đối 90 với đối chứng khỏe tại các thời điểm từ 0 giờ đến 72 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.17 Tỷ lệ gia tăng hoạt tính -1,3-glucanase của nghiệm thức có kích kháng đối 90 với đối chứng có lây bệnh tại các thời điểm từ 0 giờ đến 72 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides xiv Hình Tên hình Trang 4.18 Động thái thay đổi hoạt tính enzyme catalase trong lá hành tại các thời điểm 91 từ 0 đến 96 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.19 Tỷ lệ gia tăng hoạt tính catalase của nghiệm thức có kích kháng đối với đối 92 chứng khỏe tại các thời điểm từ 6 giờ đến 66 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.20 Tỷ lệ gia tăng hoạt tính catalase của nghiệm thức có kích kháng đối với đối 92 chứng có lây bệnh tại các thời điểm từ 6 giờ đến 66 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.21 Động thái thay đổi hoạt tính enzyme peroxidase trong lá hành tại các thời 93 điểm từ 0 đến 96 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.22 Tỷ lệ gia tăng hoạt tính peroxidase của nghiệm thức có kích kháng đối với 94 đối chứng khỏe tại các thời điểm từ 6 giờ đến 66 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.23 Tỷ lệ gia tăng hoạt tính peroxidase của nghiệm thức có kích kháng đối với 94 đối chứng có lây bệnh tại các thời điểm từ 6 giờ đến 66 giờ sau khi lây bệnh bởi nấm C. gloeosporioides 4.24 Biểu hiện gen tổng hợp enzyme chitinase trong lá hành được phân tích bằng 97 phương pháp real time PCR định lượng. xv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Diễn giải AOS Active oxygen species (hoạt tính oxy hóa cao) AUDPC Area Under Disease Progress Curve AVRDC Asian Vegetable Research and Development Center (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Rau Châu Á) BLAST Basic Local Alignment Search Tool (một giải thuật để so sánh các chuỗi sinh học) CA0 Xử lý CaCl2, không lây bệnh CAC Xử lý CaCl2 và có lây nhiễm bệnh CaCl2 Calcium chloride CSB Chỉ số bệnh DAI Days after inoculation ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long ET Ethylen FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc hay Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc) FW Fresh weight – khối lượng tươi GSLB Giờ sau lây bệnh HAI Hours after inoculation HR Hypersensitive Reaction (phản ứng siêu nhạy cảm) HQGB Hiệu quả giảm bệnh HTNN Hoàn toàn ngẫu nhiên IR Induced resistance ISR Induced Systemic Resistance (tính kháng hệ thống tạo được hay tính kháng hệ thống được cảm ứng) ITS Internal Transcript Spacer JA Jasmonic acid KHTNN Khối hoàn toàn ngẫu nhiên MAPK Mitogen Activated Protein Kinases NPR1 Nonexpressor of PR1 protein NSC Ngày sau cấy NSLB Ngày sau lây bệnh NST Ngày sau trồng PCA Potato Carrot Agar PCR Polymerase-Chain-Reaction PDA Potato Dextrose Agar xvi Từ viết tắt Diễn giải PH Phước Hậu, Vĩnh Long PR-protein Panthogensis-related protein (Protein liên quan mầm bệnh) ROI Reactive oxygen intermediates SA Salicylic acid SA0 Xử lý SA và không lây bệnh SAC Xử lý SA và lây nhiễm bệnh SAR Systemic acquired resistance SNA Saltwater Nutrient Agar SOD Superoxide dismutase TGCL Thời gian cách ly WA Water Agar xvii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Theo thống kê của FAO năm 2022, hành là một loại cây trồng rộng rãi, với sản lượng thế giới 20,9 triệu tấn trên diện tích khoảng 1,18 triệu ha. Trung Quốc và Ấn Độ là các nước trồng hành chính, tiếp theo là Hoa Kỳ, Ai Cập, Iran, Thổ Nhĩ Kỳ, Pakistan, Brazil, Liên bang Nga và Hàn Quốc (FAO, 2023). Trong canh tác, hành lá là một loại cây trồng ngắn ngày được trồng ở vĩ độ thấp, hành lá thường được gọi là "Nữ hoàng của nhà bếp” do hương vị, mùi thơm được đánh giá cao và các hợp chất có đặc tính y học của hành lá (Griffiths et al., 2002). Về giá trị sử dụng, hành lá là loại rau được sử dụng trong suốt cả năm, ví dụ như trong món cà ri, trong dạng gia vị, trong món salad như một loại gia vị hoặc nấu với các loại rau khác chẳng hạn như luộc hoặc nướng (Koch & Lawson, 1996). Hành lá (Allium fistulosum L.) được nông dân trồng phổ biến tại Vĩnh Long với diện tích xấp xỉ 1.000 ha/năm do hiệu quả kinh tế cao (Trung Thành, 2020) và Đồng Tháp (Lê Thị Trúc Phương & Dương Ngọc Thành, 2019). Tuy nhiên, canh tác hành lá chuyên canh luôn gặp nhiều khó khăn do nhiều loại mầm bệnh do nấm và vi khuẩn gây hại như bệnh cháy đầu lá do nấm Botrytis sp., bệnh đốm tím trên lá do nấm Alternaria pori, bệnh cháy lá do vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. allii, chết buội do vi khuẩn Erwinia sp., và đặc biệt là bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp. gây hại. Đây là một trong những bệnh quan trọng và gây thiệt hại nặng đến sản lượng và năng suất hành lá, nông dân chủ yếu sử dụng nhiều loại thuốc hóa học và phun nhiều lần để phòng trị bệnh (Lê Thị Trúc Phương & Dương Ngọc Thành, 2019). Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật có ảnh hưởng xấu đến môi trường và sức khỏe người sử dụng do lưu tồn của thuốc trên hành lá. Một trong những biện pháp thân thiện môi trường đã được nghiên cứu và ứng dụng trên cây trồng là kích thích tính kháng bệnh, gọi tắt là kích kháng (induced resistance). Kích kháng là biện pháp giúp cho cây trồng tạo được nhiều cơ chế chống lại mầm bệnh, do đó mang tính bền vững cao (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016). Nhiều loại hóa chất có khả năng kích kháng đã được ghi nhận trên thế giới như salicylic acid (SA), dichloroisonicotinic acid (INA), benzothiazoles (Agrios, 2005), Acibenzolar- S-Methyl, Tiadinil, Isotianil, Probenazole (PBZ), nhóm Imprimatin, Azelaic Acid (AZA), Glycerol-3-phosphate (G3P) (Tripathia et al., 2019), acid oxalic, KH2PO4, CuCl2.H2O, và chitosan (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016). Một trong những hóa chất giúp giảm bệnh cháy lá và bệnh đốm nâu trên lúa là SA 0,4 mM (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016), chất này cũng thể hiện khả năng kích thích cây trồng sản sinh các chất giúp cây trồng kháng bệnh trên cây đậu gà (Cicer arietinum L.) khi được xử lý với nồng độ 1,5 mM (War et al., 2011); đồng thời, xử lý với nồng độ 2 mM ở giai đoạn sau thu hoạch giúp giảm bệnh thán thư trên xoài (Junyu et al., 2016). Bên cạnh đó, calcium chloride 100 mM (CaCl2) cũng được ghi nhận giúp kích thích tính 1