Luận án Nghiên cứu biến thể di truyền liên quan đến các bệnh ly thượng bì bóng nước, bạch tạng và thiểu sản vành tai bằng giải trình tự hệ gen mã hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Ma Thị Huyền Thương NGHIÊN CỨU BIẾN THỂ DI TRUYỀN LIÊN QUAN ĐẾN CÁC BỆNH LY THƯỢNG BÌ BÓNG NƯỚC, BẠCH TẠNG VÀ THIỂU SẢN VÀNH TAI BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ HỆ GEN MÃ HÓA LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023 BO GIAO DUC VIFN I.IAN LAM I(HOA IJQC vA DAo rAo va cONc NGr-rE vrET NAM Hec vl[x KHoA Hec va cOxc NGHI Ma Thi Huydn Thuong NGHIEN CIIU BIEI\ THE DI TRUYEN LIEN QUAN DEN CAC BENH Ly rHrIgNG Bi BONG XII6C, BACH TANG VA THIEU SAN VANH TAI BANG CTAT TNiXTT TtI HE GEN MA HOA LUAN au rrrN si coNc NGHE srNH Hec Mfl s6: 9 42 02 0l X:ic nhfln cfra Hgc vi6n I(hoa hoc vrlr COng ngh6 Ngut'i hu'6'ng din I (K!, ghiri he tAn) Ngudi hufng din2 (Ky, Shi rd he r€n) PGS.TS. Nguy6n EIng TOn PGS.TS. Nguy6n Hii Hir Hd N|i - 2023 LOI CAM EOAN T6i xin cam atoan luin iin: "NghiAn cti'u ltiirt ilft rti truyitt li\n quun ctin cric bQnlr Ly thu'gt'trg bi bing ntui'c, Bach tottg vi ThiAu sirt vtinh toi lting gifii trinh ty hA gen mri h6o" ld c6ng trinh nghi0n c[ru cira cl-rinh minh cluoi su hr:6rrg d5n khoa hoc cira t0p th6 hu'ong dirr. LuAn 6n sir duu-rg th6ng tin tlich d5n tir nhidur uguOn tham lihio l<h6c nhar-r va cfc th6ng tir-r tr:icl-r c15n dtroc ghi r:6 ngu6n g6c. Cdc h6t qut nghiOn cin-r cira t6i cl-ro-c c6ng bd chung v6i cdc ttic gia l<hiic clii dtrcrc str nhAt tli cira clong t6c gili khi cltra vdo luin 6n. Cac so li0tr, kOt qua durcrc trinh biy trong luir-r ain ld l-rodn toiin tn-urg thr,rc vd chtra tt'r-rg cllLoc cdng b5 trong b6t kj rnQt c6ng trir-rh ndo lthirc ngoiti ciic cong trinh cong [r0 cira taic gii. Lr.rin zin cl,ro'c hodn thdr-rl-r trong thd'i gian t6i ldnr nghiCn ciru sinl-r tzri Hoc vi€n l(hoa hoc vi\ C6ng ngl-r0. ViQn FIdn lAm I(hoa hoc vi) Cong nghO Vi6t Nam. Hil l{Oi, ".qi,y lfihcing /tndtn 2023 NghiOn cri'u sinh Ma ThiHuydn Thuong ii lor cAu ox 'L rr-r6c tien, tdi xin giri ldi ciinr on chiin thi\nh vd ltinh trong siur siic trii PGS.TS Ngu1,6n Ding T6n -'frr.rirng phdng Phin tich hC gen vd PGS.'I'S Nguvdn llii I'li - Ph6 trLLdng phdng PhAn tich I'i€ ,een. Vi€n Nghi0n c[Lu hC gen. 'l'rong sLr6t qud trinh hoc tip ': r i ngJriin c[rLr, thiv cd iu6n nsl-]ient khirc huLong clAn, chi biio tin tinl-r cling nhr-r c16ng vi0n. khicl.r l€, gi[p tdi l'rodn thinh Lr-rAn iin. l-oi xin bil, td long liinh trong vd biet clr siu sirc clen (iS. 1'S N0ng Viui IIai - Chu tich Il6i cl6ng Khoa hoc Vi€n Nghi6n c[Lu h6 gen cli lur6n clLla ra nl'rirng , lii0n clong gcip vi chan thinh nhit, giirp tdi holin thiOn chc c0ng b0 lihoa hoc citt.ig nhu dtLu ra lo'i khrlyOn c1u, bhu khicl"r 16 t6i phAn c1ir,r trong hoc tiip, nghiCn citu. l-6i xin ch0n thiurh can"r o'n ciic cl6ng nghi6p cli vd clang cOng tfc tai I'hdng ['hin tich h0 gcn, ludtr tao cli0Lr hi6n. cl6ng hdnli vir giirp c10 t6i trong sr-r6t c1r-ui trinh c6ng tac, hoc tip rai Irhdng, ciac biOt l.\ 1'S. VL-r PhLrong Nhurrg. 'l'hS. Trin Thi Bich Ngoc vl\ 'l-hS^ NgLn,Sn Thi l'har-rh [Joa. -l'Oi xin chan thiurh cam crn cdc ! ki0n cliing girp. nhtn xdt chury,0n urorr str-r slic clra clic thAl' co tror.r-u, clic bLroi blio cio II6i ctOng cfc cip. c5,c nhir khoa hoc. citc cin bo trong va ngol\i Vien nghiCn c[Lu he een. Vi6n Ildn lanr l(hoa hoc vi\ C6ng n-ehe Vi0t Nam clii giirp tdi hol\n thi€r-r Lr-rAn fn r.not cach t5t nh6t. B0n canh cl6, t6i cirng xir.r chin tl-riinh clinr crn ban Linh tl4o Vi0n NghiOn c[rLr h0 ucrr. lrrrri Uirirrr tl,lc Iltrc r iirr ii fiP thi crirr lrtl llt.re r i.tn I(1r,,,, ltr.rc ri ttrrg ,rglri .li tao cli0Lr lii6n thuin loi nhit cho t6i tron-9 clud trinh hoc tiip vti nghi€r-r ciLLr. Sau cing, tOi xir-r giri loi cein.r on sAu sric ct0n gia ctinh, nguoi thin vt\ ban bc cti IuOn rlong hn\nh. d0ng r,iCr"r. Lr5 tro t6i tlong sLr6t qrii trinli hoc tip, nghien c[Lu r,ii hoin tiri0n LLrir-i /tn. tlit ^t6i, ngir.y 1)f rttting Ql nirrn 2023 Nghi0n cflu sinh Ma Thi Huy6n Thu'o'ng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... ii MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................... ix DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................ x MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................... 4 1.1 Bệnh ly thượng bì bóng nước ................................................................................ 4 1.1.1. Giới thiệu chung về ly thượng bì bóng nước..................................................... 4 1.1.2. Dịch tễ học bệnh ly thượng bì bóng nước ......................................................... 6 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh và các gen liên quan đến ly thượng bì bóng nước ............. 10 1.1.4. Các phương pháp chẩn đoán ly thượng bì bóng nước.................................... 14 1.1.5. Chăm sóc và điều trị người bệnh ly thượng bì bóng nước.............................. 17 1.2 Bệnh bạch tạng .................................................................................................... 18 1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh bạch tạng ............................................................... 18 1.2.2. Dịch tễ học bệnh bạch tạng ............................................................................. 19 1.2.3. Cơ chế bệnh sinh và các gen liên quan đến bạch tạng ................................... 21 1.2.4. Các phương pháp chẩn đoán, sàng lọc bạch tạng .......................................... 25 1.2.5. Chăm sóc và điều trị người bệnh bạch tạng ................................................... 26 1.3 Thiểu sản vành tai ................................................................................................ 27 1.3.1. Giới thiệu chung về thiểu sản vành tai............................................................ 27 1.3.2. Dịch tễ học thiểu sản vành tai ......................................................................... 28 1.3.3. Các yếu tố nguy cơ có thể dẫn đến thiểu sản vành tai .................................... 32 iv 1.3.4. Điều trị và chăm sóc người bệnh thiểu sản vành tai ...................................... 36 1.4 Công nghệ giải trình tự thế hệ mới trong nghiên cứu bệnh hiếm ........................ 36 1.5 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ..................................................................... 38 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 40 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................ 40 2.2.1. Bệnh ly thượng bì bóng nước ........................................................................... 40 2.2.2. Bệnh bạch tạng ................................................................................................. 41 2.2.3. Bệnh thiểu sản vành tai .................................................................................... 42 2.2. Đạo đức trong nghiên cứu ..................................................................................... 42 2.3. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 42 2.4. Hóa chất, trang thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 43 2.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 44 2.5.1. Chuẩn bị DNA tổng số ..................................................................................... 45 2.5.2. Giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa ................................................................ 45 2.5.3. Phân tích dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa .................................... 49 2.5.4. Giải trình tự Sanger ......................................................................................... 51 2.5.5. Phân tích ảnh hưởng ghép nối của biến thể splicing ....................................... 53 2.5.6. Khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc phản ứng ghép nối (MLPA) ........................ 54 2.5.7. Phân tích mạng lưới tương tác protein-protein ............................................... 54 2.5.8. Phân tích làm giàu tập hợp gen theo KEGG ................................................... 55 2.5.9. Phân loại khả năng gây bệnh của biến thể theo Hiệp hội Bệnh học phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ ............................................................................................. 55 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................................... 58 3.1. Đặc điểm lâm sàng ở người bệnh ............................................................................ 58 3.1.1. Ly thượng bì bóng nước ................................................................................... 58 3.1.2. Bạch tạng ......................................................................................................... 61 v 3.1.3. Thiểu sản vành tai ............................................................................................ 64 3.2. Tách chiết DNA tổng số .......................................................................................... 65 3.3. Dữ liệu thô toàn bộ hệ gen mã hóa của người bệnh ................................................ 65 3.4. Các biến thể liên quan đến bệnh .............................................................................. 67 3.4.1. Ly thượng bì bóng nước ................................................................................... 67 3.4.2. Bạch tạng ......................................................................................................... 80 3.4.3. Thiểu sản vành tai ............................................................................................ 88 CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN ............................................................................................ 102 4.1. Mối tương quan kiểu gen, kiểu hình ở nhóm người bệnh ly thượng bì bóng nước mang các biến thể gen COL7A1 và KRT5 .................................................................... 102 4.2. Phân tích di truyền giúp chẩn đoán chính xác các phân nhóm bạch tạng mà lâm sàng khó có thể chỉ ra được .......................................................................................... 108 4.3. Yếu tố di truyền trong thiểu sản vành tai .............................................................. 112 4.4. Ý nghĩa của chẩn đoán phân tử trong công tác tư vấn di truyền và quản lý bệnh hiếm .............................................................................................................................. 115 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 122 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................... 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 125 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 144 vi CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 1000G The 1000 genome project Dự án 1000 hệ gen 5'UTR 5’ untranslated region Vùng không dịch mã đầu 5' ACMG American College of Medical Genetics Hiệp hội Bệnh học phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ AD Autosomal Dominant Di truyền trội nhiễm sắc thể thường ANNOVAR ANNOtate VARiation Chú giải biến thể AR Autosomal Recessive Di truyền lặn nhiễm sắc thể thường AVV Adeno associated viral vector BA1 Benign stand-alone Tiêu chí lành tính độc lập Bmps Bone morphogenetic proteins Các protein hình thái xương BMZ Basement Membrane Zone Màng nền BOR Branchiootorenal syndrome Hội chứng cung mang-tai-thận BP1-7 Benign supporting 1-6 Tiêu chí lành tính định hướng 1-6 BS1-4 Benign strong 1-4 Tiêu chí lành tính mạnh 1-4 BWA Burrows-Wheeler Alignment Thuật toán Burrows-Wheeler CAD Computer-assisted design Thiết kế trên máy tính CAM Computer-aided manufacturing Gia công với sự hỗ trợ của máy tính cDNA Complementary DNA DNA bổ sung CFM Craniofacial Microsomia Thiểu sản sọ mặt CGH Comparative Genomics Hybridization Phép lai so sánh hệ gen CHS Chediak-Higashi syndrome Hội chứng Chediak-Higashi CNV Copy Number Variation Biến thể số lượng bản sao COLVII Type VII collagen Collagen loại VII dbSNP Database of single nucleotide polymorphisms Cơ sở dữ liệu đa hình nucleotide đơn DDEB Dominant Dystrophic Epidermolysis Bullosa Ly thượng bì bóng nước loạn dưỡng di truyền trội DEB Dystrophic epidermolysis bullosa Ly thượng bì bóng nước loạn dưỡng DMSO Dimethyl sulfoxit DNA Deoxyribonucleic acid ADN, axit deoxiribonucleic dNTP Deoxynucleoside triphosphate EB Epidermolysis Bullosa Ly thượng bì bóng nước EBS Epidermolysis bullosa simplex Ly thượng bì bóng nước đơn giản ECM Extracellular matrix Cấu trúc nền ngoại bào EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ESE Exonic Splicing Enhancers Các yếu tố tăng cường ghép nối exon ESS Exonic Splicing Silencers Các yếu tố bất hoạt ghép nối exon FATHMM Functional Analysis through Hidden Markov Models Phân tích chức năng thông qua các mô hình Markov ẩn FDR False discovery rate Tỉ lệ phát hiện sai vii FGFs Fibroblast growth factors Các yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi GATK The Genome Analysis Toolkit Bộ công cụ phân tích hệ gen gnomAD The Genome Aggregation Database Cơ sở dữ liệu tổng hợp hệ gen GS-EBS Generalized severe epidermolysis bullosa Ly thượng bì bóng nước đơn giản thể lan tỏa nặng HGMD Human genome mutation database Cơ sở dữ liệu đột biến ở người HPS Hermansky-Pudlak syndrome Hội chứng Hermansky-Pudlak HPV Human papillomavirus Vi rút gây u nhú ở người HSF Human Splicing Finder Xác định vị trí ghép nối trình tự hệ gen người IFM ImmunoFluorescence antigen Mapping Nhuộm miễn dịch huỳnh quang Indels Insertions/Deletions Thêm/mất nucleotide JEB Junctional epidermolysis bullosa Ly thượng bì bóng nước liên kết L-DOPA Levodopa LRT Likelihood ratio test Kiểm tra tỉ số khả dĩ MetaSVM Meta-analytic support vector machine Hệ thống thuật toán giám sát MITF Microphthalmia Transcription Factor Yếu tố phiên mã cảm ứng tế bào hắc tố MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification Khuếch đại đa dầu dò phụ thuộc phản ứng ghép nối mRNA Messenger Ribonucleic acid ARN thông tin MTOR Mammalian target of rapamycin Đích rapamycin ở động vật có vú NEBR The National EB Registry Hệ thống đăng ký EB quốc gia NICU Neonatal Intensive Care Unit Đơn vị chăm sóc tích cực trẻ sơ sinh NOH National Otorhinolaryngology Hospital Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương NTC Negative control Đối chứng âm OA Ocular albinism Bạch tạng mắt OAVS Oculo-auriculo-vertebral spectrum Hệ thống mắt-tai-cột sống OCA Oculocutaneous albinism Bạch tạng da và mắt OCA1-8 Oculocutaneous albinism type 1-8 Bạch tạng da và mắt loại 1-8 OCA1A Oculocutaneous albinism type 1A Bạch tạng da và mắt loại 1A OCA1B Oculocutaneous albinism type 1B Bạch tạng da và mắt loại 1B PCR Polymerase chain reaction Phản ứng đồng trùng hợp PM1-6 Pathogenic moderate 1-6 Tiêu chí gây bệnh trung bình 1-6 PP1-5 Pathogenic supporting 1-5 Tiêu chí gây bệnh định hướng 1-5 PS1-4 Pathogenic strong 1-4 Tiêu chí gây bệnh mạnh 1-4 PTC Premature termination codon Mã kết thúc sớm PVS1 Pathogenic very strong Tiêu chí gây bệnh rất mạnh qPCR Quantitative PCR PCR định lượng RDEB Recessive dystrophic Ly thượng bì bóng nước loạn dưỡng di viii epidermolysis bullosa truyền lặn RNA Ribonucleic acid ARN, axit ribonucleic RPE Retinal Pigment Epithelium Biểu mô sắc tố võng mạc SCC Squamous Cell Carcinoma Ung thư biểu mô tế bào vảy SIFT Sorting Intolerant From Tolerant SMAD Small Mothers Against Decapentaplegic SMaRT Spliceosome-mediated RNA trans- splicing SNVs Single nucleotide variants Các biến thể đơn nucleotide SPF Sun Protection Factor Định mức đo lường khả năng chống lại tia UVB/Chỉ số chống nắng SSCP Single Strand Conformation Polymorphism Đa hình cấu trúc sợi đơn TEM Transmission Electron Microscopy Kỹ thuật hiển vi điện tử THD Triple helix domain Vùng xoắn ba WES Whole exome sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa Wnts Wingless/INT ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các gen liên quan đến ly thượng bì bóng nước ............................................ 11 Bảng 1.2. Các gen liên quan đến OCA và OA .............................................................. 23 Bảng 1.3. Các hội chứng liên quan đến thiểu sản vành tai ............................................ 29 Bảng 1.4. Hệ thống phân loại thiểu sản vành tai của Weerda và nhóm nghiên cứu của Hunter ............................................................................................................................ 32 Bảng 1.5. Các gen liên quan đến thiểu sản vành tai ở chuột và so sánh với kiểu hình tai ở người ........................................................................................................................... 35 Bảng 2.1. Chuẩn bị mồi giải trình tự phù hợp với hệ thống giải trình tự NGS của Illumina với S4 flowcell phiên bản v1.5 ....................................................................... 49 Bảng 2.2. Cài đặt chu trình chạy ................................................................................... 49 Bảng 2.3. Hướng dẫn phân loại tiêu chí đánh giá theo ACMG .................................... 56 Bảng 2.4. Quy tắc phân loại biến thể gây bệnh theo ACMG ........................................ 57 Bảng 3.1. Các biểu hiện lâm sàng của những người bệnh EB ...................................... 59 Bảng 3.2. Các đặc điểm lâm sàng ở 7 người bệnh bạch tạng ........................................ 63 Bảng 3.3. Các biểu hiện lâm sàng ở những bệnh thiểu sản vành tai ............................. 64 Bảng 3.4. Kết quả đánh giá dữ liệu thô trong phân tích WES các mẫu người bệnh ly thượng bì bóng nước, bạch tạng và thiểu sản vành tai .................................................. 66 Bảng 3.5. Các biến thể liên quan được tìm thấy ở người bệnh EB ............................... 68 Bảng 3.6. Chẩn đoán xác định EB dựa trên lâm sàng kết hợp phân tích di truyền ....... 80 Bảng 3.7. Các biến thể liên quan được tìm thấy ở các người bệnh bạch tạng .............. 81 Bảng 3.8. Chẩn đoán xác định phân nhóm bạch tạng dựa trên lâm sàng kết hợp phân tích di truyền .................................................................................................................. 88 Bảng 3.9. Danh sách các gen liên quan cùng được xác định ở ít nhất 2 người bệnh thiểu sản vành tai cùng các biến thể cụ thể ................................................................... 91 Bảng 3.10. Các gen có thể liên quan đến bệnh được tìm thấy ở nhóm người bệnh thiểu sản vành tai và mô hình di truyền của chúng ................................................................ 92 Bảng 3.11. Các biến thể gây hại/có thể gây hại trên 11 người bệnh thiểu sản vành tai 94 Bảng 3.12. Các biến thể ứng viên đáp ứng mô hình di truyền đơn gen ............