Luận án Nghiên cứu đặc điểm sinh học, kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan nghệ tâm, hạc vỹ của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ LÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG PHỤC VỤ BẢO TỒN HAI LOÀI LAN NGHỆ TÂM (Dendrobium loddigesii Rolfe), HẠC VỸ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 9 62 01 10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Vũ Mạnh Hải 2. TS. Phạm Hương Sơn HÀ NỘI - 2019 Công trình hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Vũ Mạnh Hải 2. TS. Phạm Hương Sơn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2. Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 3. Thư viện.. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) và Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) là hai loài lan rừng đẹp, có giá trị y học và giá trị thương mại cao. Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư dạ dày, ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010); ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy, có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015). Hạc vỹ dùng trị ho, đau họng, bỏng lửa, toàn cây điều trị kinh phong trẻ em, ăn uống bị ngộ độc (Sách Đỏ Việt Nam, 2007). Trong xu thế nhu cầu sử dụng làm cây hoa cảnh và dược liệu tăng mạnh những năm gần đây, hai loài Nghệ tâm và Hạc vỹ đã bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt. Mặt khác, do tỷ lệ nảy mầm từ hạt trong tự nhiên rất thấp và vùng phân bố của Nghệ tâm và Hạc vỹ bị thu hẹp nên hai loài lan này đang trong tình trạng gần như mất dần trong tự nhiên. Vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ nhân giống phục vụ cho công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan này là rất cần thiết. Một trong các biện pháp hữu hiệu để nhân nhanh và bảo tồn các loài lan quý hiếm nói chung và Nghệ tâm, Hạc vỹ nói riêng là kỹ thuật nhân giống in vitro và tạo hạt giống nhân tạo, kéo dài quá trình bảo quản và cung cấp hạt giống cho sản xuất. Nhằm góp phần làm phong phú nguồn dược liệu quý của Việt Nam, làm đẹp môi trường cảnh quan, nâng cao thu nhập cho người trồng lan, chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm sinh học và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) của Việt Nam”. 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu đánh giá các đặc điểm sinh học cơ bản và biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro phục vụ công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan quý Nghệ tâm và Hạc vỹ, từng bước góp phần vào sản xuất cây dược liệu, cây cảnh có giá trị của Việt Nam. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học Các kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học có giá trị về một số biện pháp kỹ thuật nhân giống dựa trên các đặc điểm sinh học của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ, góp phần bảo tồn, khai thác và phát triển chúng một cách phù hợp trong điều kiện Việt Nam. Các kết quả nghiên cứu có tính hệ thống về đặc điểm nông sinh học, 2 dược tính và công nghệ tạo hạt giống nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ là nguồn tư liệu có giá trị, làm cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo, bổ sung vào tài liệu giảng dạy chuyên ngành trong các trường đại học, các chương trình phổ biến kiến thức cho cộng đồng. - Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả đề tài đã góp phần tích cực vào công tác bảo tồn hai loài lan dược liệu quý Nghệ tâm và Hạc vỹ của Việt Nam thông qua việc thu thập và lưu giữ với đầy đủ các thông tin bộ giống gốc bản địa. Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, đề tài đã nhân giống và tạo được hạt giống nhân tạo cùng số lượng lớn cây giống sạch bệnh, khỏe với hệ số nhân cao, góp phần mở rộng diện tích trồng hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ cho mục đích sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm phục vụ nội tiêu và hướng tới xuất khẩu với hiệu quả kinh tế cao. 4. Đóng góp mới của đề tài - Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống về các đặc điểm hình thái, cấu trúc vi phẫu và thành phần hóa sinh của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) có giá trị làm thuốc và làm cảnh cao. - Đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan quý Nghệ tâm và Hạc vỹ phù hợp với điều kiện của Việt Nam, dễ áp dụng với nguồn nguyên vật liệu trong nước nên có tính khả thi cao. - Quy trình tạo hạt giống nhân tạo và nhân giống in vitro sau bảo quản hạt hai loài lan đã kéo dài được thời gian bảo quản với tỷ lệ hạt nảy mầm từ 68% đến 70%, chi phí thấp và giữ được đặc tính giống. - Đã xác định được các biện pháp kỹ thuật cơ bản trong sản xuất cây giống in vitro và vườn sản xuất làm cơ sở để xây dựng quy trình công nghệ hoàn chỉnh về kỹ thuật sản suất hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ở Việt Nam. 5. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 130 trang không kể tài liệu tham khảo và phần phụ lục, 36 bảng kết quả nghiên cứu, 36 hình ảnh,169 tài liệu tham khảo trong và ngoài nước. Nội dung luận án gồm các phần: Mở đầu: 3 trang, Chương 1: Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài 34 trang, Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 14 trang, Chương 3: Kết quả và thảo luận 72 trang, Kết luận, đề nghị 2 trang, Tài liệu tham khảo 16 trang và phần phụ lục 25 trang. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc và phân bố của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) của Việt Nam 3 Chi Hoàng thảo (Dendrobium) được đặt tên vào năm 1799, Dendrobium được hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là lan Hoàng thảo (Trần Duy Quý, 2005). Chi lan Hoàng thảo ở Việt nam rất đa dạng và phong phú nhưng sự phân bố của chúng khá đặc thù. Lan Nghệ tâm Nam có mặt tại Thái Nguyên, Hà Giang, Lai Châu, Nghệ An (Averyanov et al., 2005). Lan Hạc vỹ phân bố tại Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai, Bắc Cạn, Ninh Thuận (Averyanov et al., 2005); Sách đỏ Việt Nam, 2007). 1.2 Một số đặc điểm thực vật học chính của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật chính của hai loài lan nghiên cứu Đặc điểm Nghệ tâm (D. loddigesii) Hạc vỹ (D. aphyllum) Thân Lan sống phụ sinh, mọc bụi nhỏ, thân mềm buông xuống dài 10 - 20 cm, có đốt thưa (Trần Hợp, 1998). Lan sống phụ sinh, thân buông xuống, mảnh dài 100 cm. (Trần Hợp, 1998). Lá Lá thuôn hình giáo, dài 4 - 6 cm, rộng 1 - 2 cm, dễ rụng (Trần Hợp, 1998). Lá xếp thành hình mác nhọn, dài 6 - 8 cm, rộng 1,5 - 2 cm (Sách Đỏ Việt Nam, 2007). Hoa Cụm hoa mọc ở nách lá, 1 - 2 hoa, mọc trên các thân mang lá, màu hơi đậm (gân đỏ) có đốm đậm. Cánh môi tròn, mép có nhiều lông mịn và ở giữa có màu vàng nghệ. Mùa hoa tháng 4 - 8 (Trần Hợp, 1998; Zhu Guanghua et al., 2009). Cụm hoa bên, 1 - 3 hoa, mọc suốt dọc chiều dài thân không mang lá, màu tím nhạt hay hơi trắng. Cánh môi màu vàng nhạt có 3 gân. Mùa hoa tháng 4 - 5 (Trần Hợp, 1998; Sách Đỏ Việt Nam, 2007). 1.3 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) ở Việt Nam Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư dạ dày, ung thư phổi, chống đông máu (Tsai et al., 2010); ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy, có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015). Lan Hạc vỹ có tác dụng bổ âm thanh nhiệt, tạo nước bọt giúp tiêu hóa, bổ phế và giảm ho (Zhao Yong Ling et al., 1994). Do có giá trị làm hoa cảnh, dược liệu và giá trị kinh tế cao nên lan Nghệ tâm và Hạc vỹ trong một số năm gần đây đã bị khai thác quá mức dẫn đến 4 nguy cơ mất hẳn trong tự nhiên. 1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và ở Việt Nam Với hoa lan, thị trường thương mại toàn cầu chủ yếu là hoa chậu và hoa cắt cành, ước tính khoảng 10% hoa tươi cắt cành được tiêu thụ trên thị trường quốc tế với giá trị trung bình trong giai đoạn từ năm 2007 đến năm 2012 là 483 triệu USD (Jayarama Reddy, 2016). Hà Lan là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan (39,7%), tiếp theo là Thái Lan (28,4%), Đài Loan (10%), Singapore (10%) và New Zealand (6%). Các nước nhập khẩu chủ yếu là Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp (7%) và Mỹ (6%). Lan cắt cành được trao đổi thương mại trên thế giới chủ yếu là các loài lan Dendrobium (chiếm 85%) và Phalaenopsis, Cymbidium (chiếm 15%). (Cheamuangphan et al., 2013; De et al., 2014). Tại Hà Lan, việc sản xuất hoa lan Dendrobium trong chậu đã tăng phổ biến đạt 40 đến 50 triệu cây (De et al., 2014). Ở Việt Nam diện tích trồng hoa lan còn rất khiêm tốn, chỉ chiếm 10% diện tích các loại hoa đang được trồng. Sản xuất hoa lan ở Việt Nam tập trung theo 2 hướng chính là sản xuất theo quy mô công nghiệp các loài lan mới lai tạo hoặc được nhập nội (lan công nghiệp) và khai thác, nuôi trồng các loài hoa lan bản địa (lan rừng). Đối với thị trường trong nước, sản lượng hoa phong lan cũng chưa đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng, chỉ khoảng 30 - 40% nhu cầu lan cắt cành còn lại phải nhập từ các nước khác. 1.5 Tình hình nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và ở Việt Nam 1.5.1 Nghiên cứu thực vật học lan Hoàng thảo (Dendrobium) Shi-Jian Yang et al., (2016), nghiên cứu đặc điểm giải phẫu và sinh lý của lá và giả hành của 4 loài D. chrysotoxum, D. officinale D. crystallinum và D. crystallinum liên quan đến sự cân bằng nước. Metusala et al., (2017) đã nghiên cứu vi phẫu lá và thân của hai loài D. capra và D. arcuatum ở các môi trường sống khác nhau liên quan đến khả năng thích ứng của hai loài trong điều kiện khô hạn. Theo y học cổ truyền, lan Nghệ tâm (D. loddigesii) có tác dụng chống tế bào ung thư dạ dày và ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010), điều trị bệnh tiểu đường type 2 (Zhang et al., 2011). Trong lan Nghệ tâm có chứa shihunine, 9,10 dihydrophenanthrene 2,4,7 triol, moscatin, loddigesiinols C, moscatilin, gigantol và tristin (Li Chunyan et al., 2013). 5 Theo nghiên cứu của Ho Kyung Jung et al., (2015) chất chiết xuất từ lan Nghệ tâm có hiệu quả ức chế melanin, ức chế hoạt động tyrosinase và phát triển dendrite, có tác dụng làm trắng da. Veronika Cakova et al., (2017) cho rằng moscatilin trong Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy. Loddigessinol G-J, Crepidatuol B có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường. Trong thân lan Hạc vỹ có polysaccharides và các hợp chất phenol như: moscatin, moscatilin và tricetin 3', 4', 5'-trimetyl ete 7-O--glucopyranoside, ức chế sản xuất NO, có hoạt động điều hòa miễn dịch. Các chất chống oxy hoá peptide được chiết xuất từ Hạc vỹ (D. aphyllum) bao gồm superoxidedismutase, catalase và glutathione peroxidase. Các axit amin: Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met và Cys chỉ ra rằng peptit DA-P có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và có hoạt động chống oxy hoá tối ưu (Huifan Liu et al., 2017). Ở Việt Nam, trong những năm gần đây hầu hết các công trình nghiên cứu đều tập trung về hình thái học của thân, lá, hoa, rễ...(Trần Hợp, 1998; Sách Đỏ Việt Nam, 2007; Dương Đức Huyến, 2007), các nghiên cứu về vi phẫu, phân loại dựa trên chỉ thị hình thái với lan Hoàng thảo còn rất hạn chế. Cao Phi Bằng và cs., (2017) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, giải phẫu và thoát hơi nước của cây phong lan Phi điệp tím (D. anosmum Lindl.) trong quá trình luyện cây ex vitro. Nguyễn Thị Mỹ Duyên và cs., (2012) đã nghiên cứu phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và tìm ra được ba loài D. pulchellum, D. gatton Sunray, D. moschatum có mối quan hệ rất gần nhau mức tương đồng lần lượt là 96,5% và 95%. Trần Duy Dương, (2015) đã kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền của 32 mẫu giống Hoàng thảo bản địa của Việt Nam trong đó có những loài có giá trị làm thuốc như Hoàng thảo Vảy rắn, Vảy rồng, Hạc vỹ Ở Việt Nam cho tới nay chưa có công trình nào công bố về thành phần hóa sinh của lan Hoàng thảo. 1.5.2 Nghiên cứu về nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới 1.5.2.1 Nghiên cứu về nhân giống in vitro Trên thế giới có rất nhiều tác giả nghiên cứu nhân giống in vitro. Dake Zhao et al., (2013) nghiên cứu nhân giống và tạo hoa trong ống nghiệm loài 6 lan D. wangliangii. Xin Qian et al., (2014) nghiên cứu sản xuất hoa và hạt giống loài lan D. officinate trong ống nghiệm đã tạo được calluses từ các đỉnh chồi trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l BA + 0,05 mg/l αNAA, nhiều chồi được tái sinh từ các mẫu PLBs khi cấy trong môi trường MS + 1 mg/l αNAA. Các cây con in vitro cao 2 - 4 cm, có khả năng ra hoa cao (83,2%) với tỷ lệ hoa bình thường 73,6% khi cấy trên môi trường MS + 15% nước dừa + 0,1 mg/l TDZ trong 9 tuần. Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) nghiên cứu nhân giống lan Hạc vỹ cho rằng môi trường Phytamax (Sigma) + 1 mg/l BA giúp cho hạt nảy mầm tốt trong lúc hệ số nhân protocorm trên môi trường Phytamax + 1 mg/l BA + 1 mg/l αNAA khá cao. Đối với loài lan D. jerdonianum Wight (Sagaya Mary et al., 2016) cho rằng môi trường MS thích hợp cho nuôi cấy từ hoa, môi trường KC phù hợp với nuôi cấy từ lá, môi trường VW phù hợp với nuôi cấy từ đốt thân. Tapash Kumar Bhowmik et al., (2017) kết luận: môi trường Phytamax (PM) có bổ sung 20 g/l sucro đem lại tỷ lệ hạt nảy mầm loài D. palpebra, cao hơn so với gluco và fructo. Thejaswini et al., (2017) cho rằng nước ép cà chua và nước dứa 15% cho tỷ lệ nảy mầm tốt nhất khi gieo hạt in vitro lan D. ovatum (Willd.). Theo Edy Setiti WidaUtami et al., (2017), bổ sung 2 g/l peptone trong môi trường VW đã được chứng minh là hàm lượng thích hợp cho sự nảy mầm của hạt, hình thành chồi với sự phát triển của protocorm. Nghiên cứu về nuôi cấy cắt lát mỏng đã được các tác giả thực hiện trên một số đối tượng: nuôi cấy cắt lát mỏng ngang thân cây con in vitro lan D. chrysotoxum (chiều dày 2 mm) Saranjeet Kaur, (2017); Paromik Bhattacharyya et al., (2018) nhân giống lan D. aphyllum từ các lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (t-TCL); Parthibhan et al., (2018) nghiên cứu tái sinh phôi soma được hình thành từ các lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (tTCL) của lan D. aqueum Lindley. Ở Việt Nam, Nguyễn Thanh Tùng và cs., (2010) nghiên cứu lát cắt mỏng đoạn thân theo chiều ngang của chồi in vitro lan Hoàng thảo thân gãy (D. aduncum), một số nghiên cứu nhân giống từ hạt in vitro cũng được tiến hành trên D. nobile Lindl (Vũ Ngọc Lan và cs., 2013), D. officinale (Nguyễn Thị Sơn và cs., 2014), D. lituiflorum Lindley (Nguyễn Văn Việt, (2017), D. transparens (La Việt Hồng và cs., 2017), D. officinale (Lê Thị Diễm và Võ Thị Bạch Mai, 2017), 1.5.2.2 Nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo hoa lan Các nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo hoa lan chủ yếu sử dụng 7 protocorm (Bunnag et al., 2010; Zhang et al., 2011; Mohanty et al., 2013; Bustam Suryanti et al., 2013; Sukhumpinij et al., 2015) hoặc từ PLBs (Nhut và cs., 2005; 2007; Trần Thị Ngọc Lan, 2013). 1.5.2.3 Nghiên cứu sinh trưởng và phát triển của cây từ hạt nhân tạo có và không qua bảo quản Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá đặc tính di truyền loài Cineraria maritana, Srivastava et al., (2009) kết luận không có sự khác biệt về di truyền giữa cây gieo hạt không bảo quản và cây từ hạt bảo quản 6 tháng. Kết quả tương tự cũng được Mishra et al., (2011) ghi nhận trên Picrorhiza kurrooa (bảo quản 3 tháng); Mohanty et al., (2013) trên D. densiflorum (bảo quản 60 ngày). 1.5.2.4 Các nghiên cứu về nuôi trồng lan Hoàng thảo Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) cho rằng giá thể thích hợp trồng cây con D. aphyllum là hỗn hợp mảnh gạch, than, xơ dừa và chất khoáng (1: 1: 0,5: 0,5). Winarto et al., (2015) khuyến cáo với cây D. ‘Zahra FR 62’ và D. ‘Gradita 31’: trồng cây trên giá thể Cycas rumphii trong 2 tháng, sau đó chuyển sang giá thể than : C. rumphii (1:1), giảm cường độ ánh sáng (100-150 μmol⋅m-2⋅s-1) bằng cách che lưới 50% với độ ẩm tương đối 85 - 95%. Tỷ lệ cây sống đạt 90 -100%. Theo Selvaraju Parthibhan et al., (2015), trồng cây D. aqueum Lindley trên giá thể mảnh gạch và than củi (1:1), để rêu trên bầu và chụp túi polyethylene giữ ẩm, tỷ lệ cây con sống cao. Abdul Aziz Mirani et al., (2017) nghiên cứu loài lan D. nobile, kết luận: cây con cấy trên môi trường MS + 3 mg/l αNAA, sau đó đem trồng trên giá thể hỗn hợp than bùn xừa: cát: đá trân châu (1,0: 1,0: 0,2) cho tỉ lệ sống 100% sau 120 ngày. Bên cạnh phân bón, một số chế phẩm sinh học và chất kích thích sinh trưởng cũng đã được sử dụng để kích thích sinh trưởng, phát triển của lan Dendrobium. Với loài lan D. cv. sonia -17 trồng trong nhà kính, Bhatt et al., (2012) cho rằng khi phun GA3 ở nồng độ 15 mg/l, số lượng chồi, chiều dài chồi và số lượng hoa đạt tối đa trên cây, trong khi BA với nồng độ 15 mg/l lại có tác dụng làm tăng số lượng lá/cây trong ở tháng thứ nhất và thứ hai Ở Việt nam, các nghiên cứu về chăm sóc và nuôi trồng lan Hoàng thảo sau ống nghiệm còn rất hạn chế. Phạm Thị Liên và cs., (2010) đề xuất quy trình trồng một số giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở miền Bắc với giá thể than củi + xơ dừa tỷ lệ 1:1, sử dụng phân bón tan chậm N:P:K tỷ lệ 8 20:20:20 và phân bón lá Grow more Vũ Ngọc Lan (2012) xác định giá thể phù hợp trồng 2 loài D.nobile và D.chrysanthum là bột xơ dừa, phun chế phẩm dinh dưỡng Komix 2 ml/l, 7 - 10 ngày/lần sau khi đưa cây in vitro ra vườn ươm một tháng. Hoàng Xuân Lam (2014) cho rằng thời vụ ra ngôi tháng 4, giá thể than + xỉ bọt núi lửa + rong biển (2:2:1); sử dụng phân bón lá Growmore (N:P:K = 30:10:10) và chất điều tiết sinh trưởng Atonik 1,8 SL (0,1%) có tác dụng tốt đến sinh trưởng, phát triển của lan D. cherry red. Nguyễn Thế Cường và cs., (2018) cho rằng trồng cây ở mật độ 44 cây/m2 và sử dụng phân bón lá Growmore có tác dụng tốt đến sinh trưởng phát triển của lan D. officinale. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu giống sử dụng trong đánh giá đặc điểm hình thái, vi phẫu và phân tích thành phần hóa sinh là mẫu lan Nghệ tâm (D. loddigesii) được thu thập ở Định Hóa - Thái Nguyên và Hạc vỹ (D. aphyllum) được thu thập ở Hòn Bà - Khánh Hòa. - Vật liệu nuôi cấy mô chồi ngọn của mẫu lan Nghệ tâm và mẫu Hạc vỹ có chiều cao 7 - 10 cm. - Vật liệu tạo phôi sinh dưỡng: Các PLBs (protocorm like bodies) tạo thành sau 6 tuần, hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Sau 6 tuần nuôi cấy, các PLBs đồng nhất sẽ được cắt ra với kích thước 3 - 4 mm để làm nguyên liệu tạo hạt nhân tạo. - Giai đoạn vườn ươm: Cây in vitro được nhân giống từ hạt nhân tạo: đạt chiều cao 5 - 6 cm, có 4 - 6 lá và 3 - 5 rễ. - Giai đoạn vườn sản xuất: Cây có chiều cao 6 -7 cm, 6 - 7 lá/cây, 3 - 4 rễ mới. - Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: Cà chua, tảo, bí ngô - Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính - Các giá thể: Rêu, vỏ thông đỏ, xơ dừa sợi, đá bọt núi lửa và dớn bảng. - Các chế phẩm dinh dưỡng: Orchid Focus grow, Seaweed (Rong biển) 95%, Đầu trâu 502, B1 Thái Lan, Growmore. - Chất kích thích sinh trưởng Superthrive. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) 9 - Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro, kỹ thuật tạo hạt nhân tạo và nhân gi