Luận án Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây thuốc thượng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU NGUYỄN TRUNG TƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY THUỐC THƯỢNG (Phaeanthus vietnamensis Ban, họ Na – Annonaceace) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU NGUYỄN TRUNG TƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY THUỐC THƯỢNG (Phaeanthus vietnamensis Ban, họ Na – Annonaceace) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 9720206 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Phạm Thanh Kỳ TS. Nguyễn Xuân Nhiệm HÀ NỘI, NĂM 2019 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận án tại Viện Dược liệu, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy, cô, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Thanh Kỳ và TS. Nguyễn Xuân Nhiệm, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện luận án. Xin bày tỏ lòng cảm ơn tới: PGS.TS. Phạm Thanh Huyền, TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng, ThS. Nguyễn Quỳnh Nga, ThS. Hoàng Văn Toán - Viện Dược liệu; TS. Bùi Văn Thanh - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật; TS. Nguyễn Hoàng Ngân - Học viện Quân y đã có những ý kiến đóng góp quý báu giúp tôi hoàn thiện luận án. Xin trân trọng cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Tài nguyên dược liệu, Phòng Quản lý khoa học và đào tạo - Viện Dược liệu; Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Dược lý, Bộ môn Giải phẫu bệnh - Học viện Quân y; Khoa Dược - Viện YHCT Quân đội; Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và cộng tác để hoàn thành luận án. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình đã luôn ủng hộ, chia sẻ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án này. Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Tác giả Nguyễn Trung Tường LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, các số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. I MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN Mục lục .................................................................................................................. I Danh mục các bảng .............................................................................................. VI Danh mục các hình ............................................................................................ VIII ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................ 1 Chương 1- TỔNG QUAN .................................................................................... 3 1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố chi Phaeanthus Hook. f. & Thomson ............................................................................................................................... 3 1.1.1. Vị trí phân loại chi Phaeanthus Hook. f. & Thomson .................................. 3 1.1.2. Phân bố và thành phần loài của chi Phaeanthus Hook. f. & Thomson ........ 6 1.1.3. Đặc điểm thực vật của chi Phaeanthus Hook. f. & Thomson ...................... 8 1.2. Thành phần hóa học ...................................................................................... 9 1.3. Công dụng theo kinh nghiệm dân gian ....................................................... 16 1.4. Tác dụng sinh học ........................................................................................ 16 1.4.1. Tác dụng chống viêm .................................................................................. 16 1.4.2. Tác dụng giãn mạch máu ...................................................................... 17 1.4.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng .............................................. 18 1.4.4. Tác dụng chống oxy hóa ............................................................................. 20 1.4.5. Tác dụng gây độc tế bào ung thư ............................................................... 20 1.4.6. Tác dụng trên hệ miễn dịch ........................................................................ 21 1.4.7. Tác dụng trong bệnh loét dạ dày và chống trầm cảm ................................ 22 1.5. Vài nét về cây thuốc Thượng ở Việt Nam ................................................... 22 1.5.1. Phân bố ....................................................................................................... 23 1.5.2. Công dụng theo dân gian ........................................................................... 23 1.5.3. Những nghiên cứu về cây thuốc Thượng ở Việt Nam ................................. 24 Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 25 II 2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 28 2.2.1. Thẩm định tên khoa học và xác định đặc điểm vi học ................................ 28 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học ................................................................. 29 2.2.3. Thử độc tính và một số tác dụng sinh học. ................................................. 38 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 49 Chương 3- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 50 3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật ................................................................... 50 3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật ....................................................................... 50 3.1.2. Thẩm định tên khoa học ............................................................................. 51 3.1.3. Đặc điểm giải phẫu .................................................................................... 52 3.1.4. Đặc điểm bột rễ, thân, lá ............................................................................ 54 3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học ............................................... 56 3.2.1. Hợp chất PV1: (7S,8R,8'R)-3,5,3′,5'-tetramethoxy-4,4',7-trihydroxy-9,9'- epoxylignan (chất mới) ......................................................................................... 57 3.2.2. Hợp chất PV2=TC5: 8R,8′R-bishydrosyringenin ...................................... 64 3.2.3. Hợp chất PV3=TC6:(+)-5,5'-dimethoxylariciresinol ................................ 66 3.2.4. Hợp chất PV4: (+)-pinoresinol .................................................................. 68 3.2.5. Hợp chất PV5: 8α-hydroxyoplop-11(12)-en-14-on (chất mới) .................. 70 3.2.6. Hợp chất PV6: spathulenol ........................................................................ 77 3.2.7. Hợp chất PV7: 1αH,5βH-aromandendrane-4β,10α-diol ........................... 79 3.2.8. Hợp chất PV8 = TC1: 1αH,5βH-aromandendrane-4α,10α-diol ............... 80 3.2.9. Hợp chất PV9: 1βH,5βH-aromandendrane-4α,10β-diol ........................... 82 3.2.10. Hợp chất PV10: 3α,4β-dihydroxybisabola-1,10-dien .............................. 84 3.2.11. Hợp chất PV11: nerolidol ........................................................................ 86 3.2.12. Hợp chất PV12:(1R,2S,4S)-2-E-cinnamoyloxy-4-acetyl-1- methylcyclohexan-1-ol (chất mới) ........................................................................ 88 3.2.13. Hợp chất PV13=TC2: N-methylcorydaldin ............................................. 94 3.2.14. Hợp chất PV14=TC3: thalifolin ............................................................... 95 3.2.15. Hợp chất PV15 = TC4: moupinamid ....................................................... 97 III 3.3. Kết quả nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học .................................. ..99 3.3.1. Độc tính cấp và bán trường diễn của CL1 và CL2 ................................. ..99 3.3.2. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm của cao lỏng CL1 và CL2 ..... 107 3.3.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của cao lỏng CL1 và CL2 ........ 113 3.3.4. Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được ............................................................................................................. 116 3.3.5. Kết quả xác định hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được ................................................................................................................... 118 Chương 4- BÀN LUẬN ................................................................................... 119 4.1. Về thực vật học .......................................................................................... 119 4.2. Về thành phần hóa học ............................................................................. 120 4.3. Về độc tính và tác dụng sinh học .............................................................. 125 4.3.1. Độc tính cấp............................................................................................. 126 4.3.2. Độc tính bán trường diễn ........................................................................ 127 4.3.3. Tác dụng chống viêm ............................................................................... 127 4.3.4. Tác dụng giảm đau .................................................................................. 131 4.3.5. Hoạt tính của các hợp chất phân lập được từ cây thuốc Thượng ........... 133 KẾT LUẬN ...................................................................................................... 138 1.1.Về thực vật học ........................................................................................... 138 1.2.Về thành phần hóa học .............................................................................. 138 1.3.Về độc tính và tác dụng sinh học ............................................................... 138 KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 140 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................................. 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 142 IV Danh mục chữ viết tắt Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton A-549 Lung adenocarcinoma epithelial cell Tế bào ung thư phổi APG Angiosperm Phylogeny Group System Hệ thống phân loại thực vật có hoa hiện đại NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory drugs Thuốc chống viêm không steroid LPS Lipopolysaccharide Lipopolysaccharid NO Nitric oxide Nitric oxid CD Circular Dichroism Phổ lưỡng sắc tròn [α]D Specific Optical Rotation Độ quay cực riêng LD50 Lethal dose 50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm OD Optical Density Mật độ quang học CC Column chromatography Sắc kí cột DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid FRAP Ferric Reducing Ability in Plasma Khả năng khử Fe+3 trong huyết tương HeLa Human henrietta lack cell Tế bào ung thư cổ tử cung người HepG2 Human hepatocellular carcinoma cell Tế bào ung thư gan người HL-60 Human acute myelocytic leukemia cell Tế bào ung thư bạch cầu người HMBC Heteronuclear multiple Bond Connectivity Tương tác dị nhân đa liên kết V HSQC Heteronuclear Single-Quantum Coherence Tương tác dị nhân lượng tử đơn IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm KB Human mouth epidermoid carcinoma cell Tế bào ung thư biểu mô người LNCaP Human prostatic carcinoma cell Tế bào ung thư tuyến tiền liệt người LU-1 Human lung carcinoma cell Tế bào ung thư phổi người MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú người NF-B Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B OVCAR-3 Ovarian carcinoma cell Tế bào ung thư buồng trứng RP-18 Reserve phase C-18 Chất hấp phụ pha đảo C-18 SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane Tetramethylsilan WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới VI DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân bố các loài thuộc chi Phaeanthus ............................................ 7 Bảng 1.2. Các alcaloid benzyl isoquinolin từ các loài thuộc chi Phaeanthus 10 Bảng 1.3. Các alcaloid isoquinolin từ các loài thuộc chi Phaeanthus ............ 12 Bảng 1.4. Các alcaloid khác từ các loài thuộc chi Phaeanthus ...................... 13 Bảng 1.5. Các hợp chất khác từ các loài thuộc chi Phaeanthus ..................... 14 Bảng 3.1. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV1 ........................................... 59 Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV2 và hợp chất tham khảo ...... 65 Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV3 và hợp chất tham khảo ...... 67 Bảng 3.4. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV4 và hợp chất tham khảo ...... 69 Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV5 và hợp chất tham khảo ...... 71 Bảng 3.6. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV6 và hợp chất tham khảo ...... 78 Bảng 3.7. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV7 và hợp chất tham khảo ...... 80 Bảng 3.8. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV8 và hợp chất tham khảo ...... 81 Bảng 3.9. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV9 và hợp chất tham khảo ...... 83 Bảng 3.10. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV10 và hợp chất tham khảo .. 85 Bảng 3.11. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV11 và hợp chất tham khảo .. 86 Bảng 3.12. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV12 ....................................... 90 Bảng 3.13. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV13 và hợp chất tham khảo .. 95 Bảng 3.14. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV14 và hợp chất tham khảo .. 96 Bảng 3.15. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV15 và hợp chất tham khảo .. 98 Bảng 3.16. Độc tính cấp theo đường uống của CL1 trên chuột nhắt trắng (n=12). ...................................................................................................... 99 Bảng 3.17. Độc tính cấp theo đường uống của CL2 trên chuột nhắt trắng (n=12). .................................................................................................... 101 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 đối với điện tim chuột cống (n=8). ...................................................................................................... 103 VII Bảng 3.19. Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 lên một số chỉ tiêu huyết học (n=8). ............................................................................................... 104 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 đối với chức năng gan và thận (n=8). .............................................................................................. 105 Bảng 3.21. Đường kính khớp cổ chân của chuột cống trắng (n=10). ........... 108 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 tới tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột cống (n=10). ........................................................................ 110 Bảng 3.23. Tỷ lệ % ức chế phù bàn chân chuột cống (I%) (n=10). .............. 111 Bảng 3.24. Tác dụng giảm khối lượng u hạt của các cao lỏng (n=10). ........ 112 Bảng 3.25. Ngưỡng đau của tổ chức viêm cấp bàn chân chuột cống trong đánh giá tác dụng của cao lỏng CL1 và CL2 (n=10). .................................... 113 Bảng 3.26. Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 tới số cơn đau quặn của chuột nhắt trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic (n=10). ........... 114 Bảng 3.27. Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 tới thời gian đáp ứng đau của chuột nhắt trắng (n=10). .................................................................. 115 Bảng 3.28. Tác dụng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất .................... 117 Bảng 3.29. Tác dụng ức chế sự sản sinh NO của các hợp chất .................... 118 VIII DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây thuốc Thượng ............................ 36 Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các chất từ thân cành cây thuốc Thượng ................ 37 Hình 3.1. Một số đặc điểm hình thái cây thuốc Thượng................................. 50 Hình 3.2. Vi phẫu rễ cây thuốc Thượng .......................................................... 52 Hình 3.3. Vi phẫu thân cây thuốc Thượng ...................................................... 53 Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu lá cây thuốc Thượng .......................................... 54 Hình 3.5. Đặc điểm bột rễ cây thuốc Thượng ................................................. 55 Hình 3.6. Đặc điểm bột thân cây thuốc Thượng ............................................. 55 Hình 3.7. Đặc điểm bột lá cây thuốc Thượng ................................................. 56 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của PV1 và hợp chất tham khảo (PV1a) ............ 57 Hình 3.9. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất PV1 ........... 58 Hình 3.10. Phổ CD của hợp chất PV1 ............................................................ 58 Hình 3.11. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PV1 .............................................. 60 Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của hợp chất PV1 ................................................... 60 Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của hợp chất PV1 .................................................. 61 Hình 3.14. Phổ HSQC của hợp chất PV1 ....................................................... 61 Hình 3.15. Phổ HMBC của hợp chất PV1 ...................................................... 62 Hình 3.16. Phổ COSY của hợp chất PV1 ....................................................... 62 Hình 3.17. Phổ NOESY của hợp chất PV1 .................................................... 63 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất PV2 .............................................. 64 Hình 3.19. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của PV3 ................. 66 Hình 3.20. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của PV4 ................. 68 Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất PV5 và hợp chất tham khảo ........ 70 Hình 3.22. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất PV5 ......... 72 Hình 3.23. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PV5 .............................................. 72 Hình 3.24. Phổ 1H-NMR của hợp chất PV5 ................................................... 73 IX Hình 3.25. Phổ 13C-NMR của hợp chất PV5 .................................................. 73 Hình 3.26. Phổ DEPT của hợp chất PV5 ........................................................ 74 Hình 3.27. Phổ HSQC của hợp chất PV5 ....................................................... 74 Hình 3.28. Phổ HMBC của hợp chất PV5 ...................................................... 75 Hình 3.29. Phổ COSY của hợp chất PV5 ....................................................... 75 Hình 3.30. Phổ NOESY của hợp chất PV5 .................................................... 76 Hình 3.31. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV6........... 77 Hình 3.32. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV7........... 79 Hình 3.33. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của PV8........... 80 Hình 3.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HM