Luận án Nghiên cứu dịch tễ học bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis - IB) ở gà nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -------------------------------- NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỀM (INFECTIOUS BRONCHITIS - IB) Ở GÀ NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ______________________________________________________________ NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM (INFECTIOUS BRONCHITIS - IB) Ở GÀ NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Lê Văn Phan TS. Lê Huỳnh Thanh Phương HÀ NỘI - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Loan ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Văn Phan và TS. Lê Huỳnh Thanh Phương, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ Tập đoàn DABACO Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những đồng nghiệp công tác tại Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam, Trung tâm Chẩn đoán Thú y DABACO đã hỗ trợ và cung cấp tài liệu cũng như các nguyên liệu cần thiết để tôi thực hiện nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan iii MUC̣ LUC̣ Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Muc̣ luc̣ ............................................................................................................................ iii Danh muc̣ các ký hiêụ và các chữ viết tắt ........................................................................ vi Danh muc̣ các bảng ........................................................................................................ viii Danh muc̣ các hình .......................................................................................................... ix Trích yếu luận án ............................................................................................................. xi Thesis abstract................................................................................................................ xiii Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................... 2 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 2 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................... 2 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 2 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 2 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................................. 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................................................. 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4 2.1. Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà ............................................................... 4 2.1.1. Lịch sử bệnh viêm phế quản truyền nhiễm trên thế giới ....................................... 4 2.1.2. Tình hình bệnh và những vấn đề nghiên cứu về bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm ở Việt Nam ................................................................................................. 7 2.2. Đặc tính sinh học của IBV .................................................................................... 9 2.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại ............................................................. 9 2.2.2. Sức đề kháng, phương thức truyền lây của IBV ................................................. 15 2.2.3. Đặc tính nuôi cấy của IBV .................................................................................. 17 2.3. Đặc điểm phân tử của virus viêm phế quản truyền nhiễm .................................. 19 2.3.1. Gen Glycoprotein S ............................................................................................. 20 2.3.2. Gen Glycoprotein S1 ........................................................................................... 21 2.3.3. Gen Glycoprotein S2 ........................................................................................... 22 iv 2.3.4. Nghiên cứu dịch tễ học IBV dựa trên genotype .................................................. 22 2.4. Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ..................................................................... 24 2.4.1. Dịch tễ học .......................................................................................................... 24 2.4.2. Phương thức truyền lây ....................................................................................... 24 2.4.3. Cơ chế gây bệnh .................................................................................................. 25 2.4.4. Triệu chứng lâm sàng .......................................................................................... 26 2.4.5. Bệnh tích ............................................................................................................. 27 2.5. Vacxin phòng bệnh ............................................................................................. 32 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 34 3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 34 3.2. Thời gian nghiên cứu .......................................................................................... 34 3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 34 3.3.1. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chẩn đoán phát hiện IBV và nghiên cứu biến đổi bệnh lý IB trên gà .......................................................................................... 34 3.3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ IB ở gà taị môṭ số tỉnh miền Bắc Việt Nam ..................................................................................................................... 34 3.3.3. Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của các chủng IBV phân lập được ..................................................................................................................... 34 3.3.4. Phân tích trình tự gen và xây dựng cây phả hệ ...................................................... 35 3.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 35 3.4.1. Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 1 .................................................................... 35 3.4.2. Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 2 .................................................................... 36 3.4.3. Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 3 .................................................................... 36 3.4.4. Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 4 .................................................................... 36 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 37 3.5.1. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 1 ............................................................ 37 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 2 ............................................................ 40 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 3 ............................................................ 44 3.5.4. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 4 ............................................................ 46 v Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 49 4.1. Ứng dụng kỹ thuật rt-pcr để chẩn đoán phát hiện IBV và nghiên cứu biến đổi bệnh lý IB ...................................................................................................... 49 4.1.1. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán phát hiện IBV ............................. 49 4.1.2. Kết quả nghiên cứu một số biến đổi bệnh lý IB ở gà .......................................... 55 4.2. Đặc điểm dịch tễ ib ở gà tại một số tỉnh miền bắc Việt Nam ............................ 67 4.2.1. Tình hình mắc IB ở gà tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam ............................... 67 4.2.2. Xác định một số yếu tố liên quan đến bệnh IB ................................................... 73 4.3. Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của các chủng IBV phân lập được ..................................................................................................................... 82 4.3.1. Phân lập IBV trên trứng gà sạch có phôi ............................................................ 82 4.3.2. Xác định một số đặc tính sinh học của các chủng IBV phân lập được ............... 86 4.4. Phân tích trình tự gen và xây dựng cây phả hệ ................................................... 91 4.4.1. Phân tích trình tự gen S1 và xây dựng cây phả hệ .............................................. 91 4.4.2. Phân tích trình tự gen S của các chủng IBV phân lập được từ thực địa ............. 99 4.4.3. Phân tích đặc điểm của các chủng IBV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam ......... 107 Phần 5. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 114 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 114 5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 114 Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án ........................................ 116 Tài liêụ tham khảo ........................................................................................................ 117 Phụ lục .......................................................................................................................... 133 vi DANH MUC̣ CÁC KÝ HIÊỤ VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ aa Amino acid BPL Betapropiolactone BHK-21 Baby hamster kidney-21 CAM Chorioallantois membrane cDNA Complementary deoxyribonucleic acid CEK Chicken embryo kidney CEL Chicken embryo liver CI Confidence interval CK Chicken kidney CPE Cytopathic effect E Envelop E.coli Escheriachia coli EID50 Embryo infection dose 50% ELD50 Embryo lethal dose 50% ED50 Embryo (infection or lethal) dose 50% ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay DNA Deoxyribonucleic acid HI Haemagglutination inhibition HVR Hypervariable region IB Infectious bronchitis IBV Infectious bronchitis virus IFA Indirect immunofluorescent assay kb Kilo base kDa Kilo dalton M Membrane MAb Monoclonal antibodies mRNA Messenger ribonucleic acid N Nucleocapsid nt Nucleotide vii OIE World organisation for Animal health ORF Open reading frame ORT Ornithobacterium rhinotracheale PCR Polymerase chain reaction PBS Phosphate-buffered saline RFLP Restriction fragment length polymorphism RNA Ribonucleic acid RNP Ribonucleoprotein RR Relative risk hay Risk ratio RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction S Spike sM Small membrane SPF Specific pathogen free TAE Tris-acetate-ethylendiamin tetraacetic acid TOC Tracheal organ culture UTR Untranslated region VN Virus neutralization VNT Virus neutralization test viii DANH MUC̣ CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................................... 39 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ..................................................................... 39 3.3. Bảng 2x2 về quan hệ yếu tố khảo sát với IB theo đàn ........................................ 43 4.1. Kết quả chẩn đoán IB bằng phương pháp RT-PCR ............................................ 54 4.2. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng chủ yếu của gà mắc IB ..................... 57 4.3. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc IB ............................... 61 4.4. Sản lượng trứng của gà đẻ mắc IB ...................................................................... 62 4.5. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể của gà mắc IB ................................ 64 4.6. Tỉ lệ gà mắc IB trên địa bàn nghiên cứu ............................................................. 68 4.7. Tỷ lệ gà mắc IB theo lứa tuổi gà trên địa bàn nghiên cứu .................................. 69 4.8. Tỷ lệ gà mắc IB theo mùa trên địa bàn nghiên cứu ............................................ 71 4.9. Yếu tố nguy cơ về phương thức chăn nuôi ......................................................... 73 4.10. Yếu tố nguy cơ về quy mô chăn nuôi ................................................................. 75 4.11. Yếu tố nguy cơ về tiêm phòng vacxin IB ........................................................... 76 4.12. Yếu tố nguy cơ về nguồn gốc giống ................................................................... 78 4.13. Yếu tố nguy cơ về vị trí trang trại ....................................................................... 79 4.14. Yếu tố nguy cơ về vệ sinh chuồng trại ................................................................ 80 4.15. Thông tin về các chủng IBV phân lập được ....................................................... 85 4.16. Kết quả kiểm tra sự thích nghi của các chủng IBV trên phôi gà ........................ 86 4.17. Kết quả tổng hợp số phôi chết và số phôi nhiễm IBV ở từng nồng độ gây nhiễm .... 89 4.18. Kết quả tính EID50/ml và ELD50/ml .................................................................... 90 4.19. Các chủng IBV tham chiếu được sử dụng so sánh với chủng VNUA-HN01 ..... 94 4.20. Mức độ tương đồng về nucleotide và amino acid của chủng VNUA-HN01 so sánh với các chủng tham chiếu ........................................................................... 95 4.21. So sánh mức độ tương đồng nucleotide và amino acid của gen S của các chủng IBV phân lập ở Việt Nam và các chủng IBV tham chiếu khác ........................ 101 ix DANH MUC̣ CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1. Hình ảnh IBV trên kính hiển vi điện tử ................................................................ 10 2.2. Tổ chức hệ gen của IBV với các điểm nóng đột biến, mối quan hệ với sự sửa đổi trong glycoprotein spike và nucleoprotein của virus và tầm quan trọng liên quan đến các đặc tính sinh học và miễn dịch học của IBV ........................ 12 2.3. Tổ chức bộ gen điển hình của coronavirus gia cầm ............................................. 20 2.4. Gà bị nhiễm IBV .................................................................................................. 26 2.5. Bất thường về hình dạng và kích cỡ trứng gà bị nhiễm IBV (a) .......................... 27 2.6. Khí quản tiết dịch nhầy, tắc nghẽn và tăng trương lực (a); các vùng tập trung viêm phổi nhẹ (b) ................................................................................................. 28 2.7. Thận sưng và sung huyết do IBV ......................................................................... 29 2.8. Bệnh tích đại thể ở phủ tạng của gà nhiễm IBV. (a) tích tụ lòng đỏ trứng trong xoang bụng; (b) gan sưng, nhợt nhạt và dễ vỡ; (c) xuất huyết nhiều trên bề mặt dạ dày tuyến, (d) dạ dày cơ và (e) ruột non .............................................. 30 2.9. Sự giãn nở của toàn bộ ống dẫn trứng .................................................................. 30 2.10. Bằng chứng về chất tiết niêm mạc của tế bào biểu mô (a) và sự xâm nhập của tế bào lympho trong biểu mô (b) ................................................................... 31 3.1. Thu hoạch nước xoang niệu nang sau khi phân lập IBV trên phôi gà ................. 44 4.1. Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của các IBV trong GenBank - Tóm tắt bằng đồ hoạ ......................................................... 49 4.2. Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của các IBV trong GenBank - Các trình tự tạo ra bắt cặp có ý nghĩa ............................... 50 4.3. Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của các IBV trong GenBank - Sự bắt cặp ......................................................................... 50 4.4. Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của chủng virus vacxin IB 4-91 .................................................................................. 51 4.5. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR trong chẩn đoán IB .......... 52 4.6. Kết quả kiểm tra độ nhạy của phản ứng RT- PCR để chẩn đoán IB .................... 53 4.7. Kết quả chẩn đoán IB trên gà bằng phương pháp RT- PCR ................................ 54 4.8. Các triệu chứng lâm sàng của gà mắc IB ............................................................. 56 x 4.9. Bệnh lý đại thể của gà mắc IB (A, B, C, D G, H) và hình dạng trứng gà dị dạng, vỏ lụa, lòng trắng loãng do IB (E, F, I) ...................................................... 60 4.10. Hình ảnh bệnh lý vi thể của gà mắc IB ................................................................ 67 4.11. Kết quả diện di sản phẩm RT-PCR từ các mẫu sau phân lập đời P5. M:Maker .............................................................................................................................. 83 4.12. Kết quả gây nhiễm IBV trên phôi gà .................................................................... 84 4.13. Kết quả nhân gen S1 (1.7 kb) của chủng virus ck/VN/VNUA-HN01/2014 bằng phản ứng RT-PCR ....................................................................................... 92 4.14. Kết quả phân biệt pl