Luận án Nghiên cứu điều chế alginate khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng chống đông máu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG ĐÔNG MÁU LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP DÙNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG ĐÔNG MÁU Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 9540105 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. VŨ NGỌC BỘI 2. PGS. TS. TRẦN THỊ THANH VÂN KHÁNH HÒA - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Một số kết quả trong luận án này được tài trợ kinh phí từ Đề tài hợp tác quốc tế: “Polysaccharide sulfate từ tảo nâu Việt Nam: Cấu trúc và hoạt tính sinh học”, Mã số: VAST.HTQT.NGA. 06/13-14, thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Liên bang Nga, Đề tài “Cấu trúc và hoạt tính sinh học của một vài ionic Polysaccharide chiết tách từ tảo biển ở Nhật Bản và Việt Nam”, Mã số: VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15, thuộc chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với Nhật Bản và Đề tài: “Nghiên cứu điều chế dẫn xuất polyguluronat sunphat hóa trọng lượng phân tử thấp từ nguồn rong mơ Việt Nam để ứng dụng trong dược phẩm”, Mã số: VAST06.05/12-13 mà tôi là một trong những thành viên tham gia thực hiện và đã được Chủ nhiệm đề tài đồng ý cho phép sử dụng trong báo cáo Luận án. Các kết quả, số liệu nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào. Khánh Hòa, Ngày tháng 3 năm 2019 NGHIÊN CỨU SINH NGUYỄN VĂN THÀNH ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này, Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, Lãnh đạo khoa Sau Đại học sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho các thầy: PGS. TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang và PGS. TS. Trần Thị Thanh Vân - Nguyên Trưởng phòng Hóa phân tích - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Bùi Minh Lý - người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền cảm hứng, định hướng nghiên cứu cho tôi trong giai đoạn đầu thực hiện Luận án này. Vì lý do sức khỏe nên Thầy đã không thể tiếp tục hướng dẫn nghiên cứu. Xin chân thành cám ơn: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Chủ nhiệm đề tài quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA. 06/13-14, VAST.HTQT.NHATBAN.02/13-15 và VAST06.05/12- 13 đã hỗ trợ kinh phí để tôi hoàn thành Luận án có chất lượng. Xin cám ơn Lãnh đạo Trường Đại học Kiên Giang đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được đi học và hoàn thành Luận án này. Xin chân thành cám ơn các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quý báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các cán bộ thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Gia đình và bạn bè thân thiết đã giúp đỡ, chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. Khánh Hòa, Ngày tháng 3 năm 2019 NGHIÊN CỨU SINH NGUYỄN VĂN THÀNH iii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................vi DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... viii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................xi MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 4 1.1. NGUỒN LỢI RONG NÂU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM ............................. 4 1.1.1. Giới thiệu chung về rong nâu ................................................................................ 4 1.1.2. Một số thành phần hóa học của rong nâu .............................................................. 4 1.1.3. Tình hình sử dụng rong nâu trên thế giới .............................................................. 6 1.1.4. Rong nâu Việt Nam ............................................................................................... 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ ALGINATE ............................................................................... 9 1.2.1. Giới thiệu về alginate ............................................................................................ 9 1.2.2. Cấu trúc và tính chất hóa học của alginate .......................................................... 10 1.2.3. Kỹ thuật tách chiết alginate từ rong nâu .............................................................. 13 1.3. ĐIỀU CHẾ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP ................................ 20 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới điều chế alginate khối lượng phân tử thấp ............ 20 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước điều chế alginate khối lượng phân tử thấp .............. 25 1.4. ỨNG DỤNG CỦA ALGINATE VÀ ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 28 1.5. QUÁ TRÌNH ĐÔNG MÁU VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA ALGINATE ................................................................................................................... 32 1.5.1. Lý thuyết của quá trình đông máu ....................................................................... 32 1.5.2. Các nghiên cứu hoạt tính chống đông máu của alginate ..................................... 35 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 39 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................................ 39 2.1.1. Rong mơ nguyên liệu .......................................................................................... 39 2.1.2. Nguyên vật liệu dùng cho xác định độc chất trên chuột ..................................... 41 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 41 2.2.1. Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu .................................................................... 41 2.2.2. Các phương pháp phân tích fucoidan và sodium alginate ................................... 41 2.2.3. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học cơ bản của rong nâu ............... 44 iv 2.2.4. Phương pháp đánh giá chất lượng alginate: ........................................................ 44 2.2.5. Phương pháp định lượng vi sinh vật .................................................................... 44 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính chống đông máu và độc tính của SGS ............ 44 2.2.7. Phương pháp bố trí thực nghiệm ......................................................................... 47 2.3. HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG ............................. 58 2.4. PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU ........................................... 59 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................... 60 3.1. NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC LOÀI RONG NÂU DÙNG CHO SẢN XUẤT FUCOIDAN VÀ SODIUM ALGINATE ...................................................................... 60 3.1.1. Đánh giá hàm lượng fucoidan và sodium alginate ở một số loài rong nâu ......... 60 3.1.2. Xác định thành phần hóa học cơ bản của rong nâu T. ornata ............................. 66 3.2. NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CÔNG ĐOẠN NẤU CHIẾT SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU T. ORNATA ....................................................................................... 70 3.3. NGHIÊN CỨU THU NHẬN SODIUM ALGINATE TỪ RONG NÂU VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SODIUM ALGINATE ............................................................... 83 3.3.1. Nghiên cứu xác định nồng độ ethanol kết tủa thu nhận sodium alginate ............ 83 3.3.2. Đề xuất quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu T. ornata ..................... 84 3.3.3. Sản xuất thử và đánh giá chất lượng sản phẩm sodium alginate ......................... 87 3.3.4. Xác định khối lượng phân tử trung bình của sodium alginate ............................ 89 3.3.5. Xác định các đặc tính cấu trúc của sodium alginate thu nhận từ rong T. ornata 92 3.4. NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SODIUM ALGINATE KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP ........................................................................................................ 104 3.4.1. Xác định hàm lượng các sodium alginate khối lượng phân tử thấp .................. 104 3.4.2. Xác định các đặc tính cấu trúc của các alginate khối lượng phân tử thấp ........ 107 3.4.3. Khối lượng phân tử trung bình của alginate khối lượng phân tử thấp .............. 112 3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ SODIUM GULURONATE SULFATE (SGS) TỪ SODIUM ALGINATE TÁCH CHIẾT TỪ RONG T.ORNATA VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA SGS ................................................................................................ 115 3.5.1. Nghiên cứu điều chế SGS từ sodium alginate tách chiết từ rong nâu T. ornata .... 115 3.5.2. Đề xuất quy trình sản xuất SGS từ sodium alginate của rong nâu T. ornata và đánh giá các đặc tính của SGS ............................................................................................. 126 3.6. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SGS .......................................................................................................... 131 v 3.6.1. Đánh giá hoạt tính chống đông máu in vitro của SGS ...................................... 131 3.6.2. Đánh giá độc tính của SGS trên chuột thí nghiệm ............................................ 137 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN.......................................................................... 147 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN........ 149 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 150 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APTT : Activated partial thromboplastin time (Thời gian đông máu nội sinh) cP : Centipoise (đơn vị đo độ nhớt) DS : Degree of substitution (Độ thay thế) FT-IR : Fourrier Transformation InfraRed spectroscopy (Quang phổ hồng ngoại) G : Guluronate (guluronic acid) GPC : Gel Permeation Chromatography (Sắc ký thẩm thấu gel) IR : InfraRed spectroscopy (Phổ hồng ngoại) M : Mannuronate (mannuronic acid) NMR : Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) PT : Prothrombin time (Thời gian đông máu ngoại sinh) SG : Sodium guluronate SGS : Sodium guluronate sulfate SM : Sodium mannuronate S. mcclurei : Sargassum mcclurei SMG : Sodium mannuronate - sodium guluronate S. polycystum : Sargassum polycystum TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam T. ornata : Turbinaria ornata TT : Thrombin time (Thời gian đông máu chung) v : Volume (Thể tích) w : Weight (Khối lượng) vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Thiết kế nghiên cứu độc tính của SGS .......................................................... 46 Bảng 2.2. Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính của SGS ............... 46 Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của rong nâu T. ornata ..................................... 67 Bảng 3.2. Điều kiện thí nghiệm được chọn ................................................................... 70 Bảng 3.3. Kết quả ma trận thực nghiệm trực giao cấp I ................................................ 71 Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo hàm lượng sodium alginate .................. 75 Bảng 3.5. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo độ nhớt sodium alginate ....................... 80 Bảng 3.6. Hệ số của phương trình hàm đa mục tiêu ..................................................... 81 Bảng 3.7. Kết quả thí nghiệm tối ưu hàm đa mục tiêu .................................................. 82 Bảng 3.8. Trạng thái chất lượng của sodium alginate ................................................... 87 Bảng 3.9. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu lý hóa của sodium alginate ...................... 88 Bảng 3.10. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu vi sinh của sodium alginate ................... 88 Bảng 3.11. Kết quả phổ IR của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ........................ 93 Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của sodium alginate từ rong T. ornata ... 96 Bảng 3.13. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của sodium alginate từ rong T. ornata .... 98 Bảng 3.14. Tương tác proton từ phổ 1H-1H COSY của sodium alginate từ rong Turbinaria ornata ........................................................................................................ 100 Bảng 3.15. Khối lượng trung bình của chuột nhóm I (đánh giá độc tính cấp) ............ 138 Bảng 3.16. Khối lượng trung bình của chuột nhóm II (giai đoạn hồi phục) ............... 139 Bảng 3.17. Tổng hợp kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm I ............................. 141 Bảng 3.18. Kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột nhóm II ........................................... 142 Bảng 3.19. Kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu ....................................... 143 Bảng 3.20. Kết quả quan sát xác định khối lượng tươi của gan, lách, thận của chuột thí nghiệm ......................................................................................................................... 144 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Liên kết (14) glycosidic giữa các uronic ................................................... 11 Hình 1.2. Cấu trúc 2 gốc uronic trong phân tử alginate ................................................ 11 Hình 1.3. Độ dài trung bình giữa các uronic trong các block của alginate ................... 11 Hình 1.4. Sự sắp xếp các block polysaccharide trong phân tử alginate ........................ 12 Hình 1.5. Các giai đoạn của quá trình đông máu .......................................................... 33 Hình 1.6. Cơ chế tạo thành phức hợp prothrombinase theo con đường nội sinh và ngoại sinh ................................................................................................................................. 34 Hình 2.1. Hình ảnh về rong mơ Sargassum mcclurei Setchell ..................................... 39 Hình 2.2. Hình ảnh về rong mơ Sargassum polycystum C. Agardh ............................. 39 Hình 2.3. Hình ảnh về rong cùi bắp Turbinaria ornata (Turner) J. Agardh ................. 39 Hình 2.4. Vị trí thu mẫu rong mơ .................................................................................. 39 Hình 2.5. Sơ đồ cách thức tiếp cận các nội dung nghiên cứu của luận án ................... 47 Hình 2.6. Sơ đồ sàng lọc loài rong nâu ......................................................................... 49 Hình 2.7. Sơ đồ tối ưu hóa công đoạn nấu chiết sodium alginate ................................. 50 Hình 2.8. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol kết tủa sodium alginate ..... 51 Hình 2.10. Sơ đồ điều chế sodium alginate khối lượng phân tử thấp ........................... 52 Hình 2.10. Phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa....................................................... 53 Hình 2.11. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS ......................................................................................... 54 Hình 2.12. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS ......................................................................................... 54 Hình 2.13. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NaHSO3/NaNO2 phản ứng điều chế tác nhân sulfate hóa đến độ thay thế của SGS .................................................................... 55 Hình 2.14. Phản ứng tổng hợp sodium guluronate sulfate ............................................ 55 Hình 2.15. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS ......................................................................................................................... 56 ix Hình 2.16. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS ......................................................................................................................... 57 Hình 2.17. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NaNO2/SG phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS............................................................................................................ 57 Hình 2.18. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH phản ứng tổng hợp đến độ thay thế của SGS ................................................................................................................................ 58 Hình 3.1. Sự biến đổi hàm lượng fucoidan ở 3 loài rong nâu theo thời gian thu mẫu .. 60 Hình 3.2. Sự biến đổi hàm lượng sodium alginate ở 3 loài rong nâu theo thời gian thu mẫu ................................................................................................................................ 64 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng sodium alginate thu được sau kết tủa ............................................................................................................................ 83 Hình 3.4. Sơ đồ quy trình sản xuất sodium alginate từ rong nâu T. ornata .................. 85 Hình 3.5. Sắc ký đồ GPC của sodium alginate ............................................................. 90 Hình 3.6. Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium alginate .................................... 90 Hình 3.7. Phổ hồng ngoại của sodium alginate từ rong nâu T. ornata.......................... 92 Hình 3.8. Phổ ESI-MS của sodium alginate từ rong nâu T. ornata .............................. 93 Hình 3.9. Phổ ESI-MS của disaccharide tại m/z 369 .................................................... 94 Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ......................... 95 Hình 3.11. Phổ 1H -NMR của sodium alginate thu được từ rong nâu T. ornata .......... 97 Hình 3.12. Phổ COSY của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ............................. 100 Hình 3.13. Phổ HSQC của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ............................. 101 Hình 3.14. Phổ HMBC của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ............................ 102 Hình 3.15. Phổ ROESY của sodium alginate từ rong nâu T. ornata .......................... 103 Hình 3.16. Tương tác của các proton trên phổ ROESY của sodium alginate từ rong nâu T. ornata ...................................................................................................................... 104 Hình 3.17. Hàm lượng các sodium alginate khối lượng phân tử thấp......................... 105 Hình 3.18. Phổ 13C-NMR của sodium guluronate ....................................................... 107 Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của sodium guluronate ........................................................ 109 Hình 3.20. Phổ 13C-NMR của sodium polymannuronate ............................................ 110 x Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của sodium polymannuronate ............................................. 111 Hình 3.22. Sắc ký đồ của GPC của sodium guluronate .............................................. 112 Hình 3.23. Sự phân bố khối lượng phân tử của sodium guluronate ............................ 112 Hình 3.24. Sắc ký đồ