Luận án Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại đồng bằng sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRƯƠNG VĂN XẠ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG VÀ CƠ CHẾ KÍCH THÍCH TÍNH KHÁNG BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA CỦA HỢP CHẤT TRONG CÁC LOÀI THỰC VẬT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 9420201 Năm 2024 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRƯƠNG VĂN XẠ MÃ SỐ NCS: P0920002 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG VÀ CƠ CHẾ KÍCH THÍCH TÍNH KHÁNG BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA CỦA HỢP CHẤT TRONG CÁC LOÀI THỰC VẬT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 9420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN ĐẮC KHOA TS. NGUYỄN ĐỨC ĐỘ Năm 2024 CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận án này với tựa đề là “Nghiên cứu khả năng và cơ chế kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá lúa của hợp chất trong các loài thực vật tại Đồng bằng Sông Cửu Long” do nghiên cứu sinh Trương Văn Xạ thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Đắc Khoa và TS. Nguyễn Đức Độ. Luận án đã báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thông qua ngày: // Luận án đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại. Thư ký (ký tên) Ủy viên (ký tên) Ủy viên (ký tên) Phản biện 3 (ký tên) Phản biện 2 (ký tên) Phản biện 1 (ký tên) Người hướng dẫn (ký tên) Chủ tịch Hội đồng (ký tên) LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận án, em đã nhận được sự giúp đỡ và hỗ trợ của nhiều tổ chức và cá nhân. Qua đây, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Ban Chủ nhiệm Khoa Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành luận án. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS. Nguyễn Đắc Khoa đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm, giúp đỡ, động viên cho em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án. Em xin gửi lời cám ơn đến thầy TS. Nguyễn Đức Độ đã tận tình hướng dẫn em những nội dung nghiên cứu về trích ly các hợp chất thực vật trong luận án. Em xin gửi lời cám ơn đến quý thầy cô đã tham gia Hội đồng đề cương, Hội đồng chuyên đề và tiểu luận tổng quan, Hội đồng báo cáo giữa kỳ, Hội đồng seminar toàn luận án, Hội đồng báo cáo luận án cấp cơ sở, Quý nhà khoa học Phản biện độc lập có những đóng góp quý báu giúp em chỉnh sửa và hoàn thiện luận án tốt hơn. Xin gửi lời cám ơn đến các bạn, các em trong nhóm nghiên cứu Bệnh hại Thực vật và phòng thí nghiệm Sinh hóa ứng dụng của Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã hỗ trợ nhiệt tình trong quá trình tôi thực hiện luận án. Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn ủng hộ và giúp đỡ để cho tôi hoàn thành chương trình nghiên cứu sinh và luận án này. Xin trân trọng cám ơn. Nghiên cứu sinh Trương Văn Xạ i TÓM TẮT Cháy bìa lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) là bệnh quan trọng trên ruộng lúa. Luận án này khảo sát khả năng giúp giảm bệnh và cơ chế kích kháng của các hợp chất có trong dịch trích các loài thực vật bản địa tại Đồng bằng Sông Cửu Long, nhằm hình thành biện pháp phòng trị bệnh thân thiện với môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng đồng, nâng cao năng suất và chất lượng lúa gạo. Dịch trích cỏ cứt heo, cỏ hôi và sống đời không ảnh hưởng đến khả năng nẩy mầm và phát triển của hạt lúa và giúp giảm chiều dài vết bệnh tương đương với thuốc hóa học Starner 20WP. Cây sống đời được xác định là loài Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự vùng gen ITS. Tất cả vật liệu từ dịch trích lá sống đời đều không ảnh hưởng đến khả năng nẩy mầm và phát triển của hạt lúa. Trong ba loại cao tổng lá sống đời được ly trích bằng phương pháp tách chiết lỏng-lỏng, cao tổng methanol có hiệu quả tương đương với Starner 20WP nên được phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột silica gel với bốn hệ dung môi khác nhau để tạo ra bốn loại cao phân đoạn F1, F2, F3 và F4. Cao phân đoạn F3 (dung môi acetone) có hiệu quả tương đương với Starner 20WP. Khả năng giúp giảm bệnh cháy bìa lá của các loại dịch trích thực vật và cao chiết lá sống đời có liên quan đến cơ chế kích kháng. Kết quả khảo sát hoạt tính của bốn enzyme liên quan đến cơ chế kháng bệnh cháy bìa lá gồm peroxidase, catalase, polyphenol oxidase và phenylalanine ammonia lyase cho thấy hoạt tính của các enzyme tăng cao và sớm khi hạt giống được ngâm với các loại dịch trích thực vật và cao chiết này. Sử dụng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), bốn hợp chất có khả năng kích kháng thực vật gồm (i) 5-oxotetrahydrofuran-2,3-dicarboxylic acid, dimethyl ester, (ii) linoleic acid, (iii) ethyl linolenate và (iv) 1,3-benzenedicarboxylic acid, bis(2- ethylhexyl) ester được phát hiện với tỷ lệ cao (>5%) trong cao tổng methanol và cao phân đoạn F3. Kết quả khảo sát đối chiếu khả năng giúp giảm bệnh của các sản phẩm thương mại gồm Dimethyl furan-2,5-dicarboxylate (FDME) [giống cấu trúc (i)], Linoleic acid-water soluble (LinA) [giống cấu trúc (ii) và (iii)] và Bis(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) [giống cấu trúc (iv)] cho thấy hỗn hợp FDME và DEHP tỷ lệ 10%:8% và 10%:10% có khả năng giúp giảm chiều dài vết bệnh tương đương với thuốc Starner 20WP; vì vậy, có thể suy ra hai hợp chất hiện diện trong lá sống đời là 5- oxotetrahydrofuran-2,3-dicarboxylic acid, dimethyl ester (cấu trúc giống với FDME) và 1,3-benzenedicarboxylic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (cấu trúc giống với DEHP) có liên quan đến cơ chế kích kháng giúp giảm bệnh cháy bìa lá lúa Từ khóa: cao chiết, Kalanchoe pinnata, kích kháng, Oryza sativa, Xanthomonas oryzae pv. oryzae ii ABSTRACT Bacterial leaf blight (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) is an important rice disease. This study aims at testing for disease-reducing effects of bioactive compounds in extracts of indigenous plants in the Mekong Delta of Vietnam and investigating the involvement of induced resistance in the observed disease reduction. This helps make an eco-friendly strategy to control the disease thus improve rice yield and quality. Aqueous crude extracts of either cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides), cỏ hôi (Chromolaena odorata) or sống đời (Kalanchoe pinnata) did not show any adverse effects on rice seed germination and development. Seed soaking using these extracts reduced lesion lengths on rice leaves similar to application of the bacteriocide Starner 20WP did. Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. used in this study was identified based on its morphological characteristics and the ITS gene sequence. All extracts made from K. pinnata leaves using different extraction methods did not show any adverse effects on rice seed germination and development. Among the three leaf extracts made by the liquid-liquid extraction method using three different solvents, methanol extract reduced lesion lengths similar to Starner 20WP did. Four fractionated extracts F1, F2, F3 and F4 were obtained when the methanol extract was fractionated by silica gel column chromatography using four different solvents. The F3 extract (fractionated in acetone solvent) reduced lesion lengths similar to Starner 20WP did. Induced resistance involves in the observed disease reduction. Indeed, activities of the four defense-related and/or antioxidant enzymes, i.e., peroxidase, catalase, polyphenol oxidase and phenylalanine ammonia lyase, increased early in rice leaves after seed soaking application with the extracts. Using Gas Chromatography Mass Spectrometry, the four bioactive compounds including (i) 5-oxotetrahydrofuran-2,3-dicarboxylic acid, dimethyl ester, (ii) linoleic acid, (iii) ethyl linolenate and (iv) 1,3-benzenedicarboxylic acid, bis(2-ethylhexyl) ester were detected with high proportions in both methanol and F3 extracts (>5%). The commercially available chemicals having similar structures with these compounds were used to have sufficient materials for validation studies. They include Dimethyl furan- 2,5-dicarboxylate (FDME) [equivalent of (i)], Linoleic acid-water soluble (LinA) [equiv. (ii) and (iii)] and Bis(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) [equiv. (iv)]. Seed soaking using the mixture of FDME and DEHP either 10%:8% or 10%:10% provided similar protection against rice bacterial leaf blight as that of the chemical control. Therefore, the two bioactive compounds 5-oxotetrahydrofuran-2,3-dicarboxylic acid, dimethyl ester (equiv. FDME) and 1,3-benzenedicarboxylic acid, bis(2-ethylhexyl) ester (equiv. DEHP) detected in K. pinnata leaf extracts are attributed to induce rice resistance against bacterial leaf blight. Keywords: induced resistance, Kalanchoe pinnata, Oryza sativa, plant extract, Xanthomonas oryzae pv. oryzae iii iv MỤC LỤC TÓM TẮT ................................................................................................................ i ABSTRACT ............................................................................................................ ii LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. iii MỤC LỤC .............................................................................................................. iv DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................. ix DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. xiv CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ................................................................................... 1 1. 1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu ............................................................................................................... 3 1.2.1 Mục tiêu chung ............................................................................................. 3 1.2.2 Mục tiêu cụ thể ............................................................................................. 3 1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 3 1.4 Ý nghĩa của nghiên cứu ....................................................................................... 4 1.4.1 Ý nghĩa khoa học ......................................................................................... 4 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................... 4 1.5 Tính mới của luận án ........................................................................................... 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 6 2.1 Bệnh cháy bìa lá lúa ............................................................................................ 6 2.1.1 Lược sử bệnh ................................................................................................ 6 2.1.2 Triệu chứng bệnh ......................................................................................... 9 2.1.3 Mầm bệnh ................................................................................................... 10 2.1.4 Quy luật phát sinh bệnh.............................................................................. 10 2.1.5 Biện pháp phòng trừ bệnh .......................................................................... 11 2.2 Tính kháng bệnh của cây trồng ......................................................................... 12 2.2.1 Khái niệm tính kháng bệnh của cây trồng .................................................. 12 2.2.2 Kích thích tính kháng bệnh của cây trồng .................................................. 13 2.3 Các nghiên cứu về cơ chế kích kháng trên cây trồng ........................................ 15 Trang v 2.3.1 Cơ chế kích kháng của cây trồng thông qua các rào cản vật lý ................. 15 2.3.2 Cơ chế kích kháng của cây trồng thông qua các phản ứng sinh hóa ......... 16 2.3.2.1 Enzyme peroxidase .......................................................................... 17 2.3.2.2 Enzyme catalase .............................................................................. 18 2.3.2.3 Enzyme polyphenol oxidase ............................................................ 19 2.3.2.4 Enzyme phenylalanine ammonia lyase ........................................... 20 2.4 Các hợp chất sinh học trong thực vật ................................................................ 20 2.4.1 Nhóm hợp chất phenolic ............................................................................ 22 2.4.2 Nhóm hợp chất flavonoid ........................................................................... 23 2.4.3 Nhóm hợp chất coumarine ......................................................................... 24 2.5 Phương pháp chiết xuất các hợp chất sinh học.................................................. 25 2.5.1 Tổng quan phương pháp chiết xuất ............................................................ 25 2.5.2 Các phương pháp chiết xuất hợp chất sinh học ......................................... 26 2.5.3 Các phương pháp sắc ký xác định các hợp chất sinh học .......................... 27 2.5.4 Các nghiên cứu xác định hợp chất sinh học bằng phương pháp GC-MS .. 29 2.6 Các loại thực vật sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 30 2.6.1 Cà độc dược................................................................................................ 30 2.6.2 Cỏ cứt heo .................................................................................................. 31 2.6.3 Cỏ hôi ......................................................................................................... 31 2.6.4 Cỏ mực ....................................................................................................... 32 2.6.5 Đậu biếc ..................................................................................................... 33 2.6.6 Diếp cá ....................................................................................................... 34 2.6.7 Diệp hạ châu ............................................................................................... 35 2.6.8 Húng quế .................................................................................................... 36 2.6.9 Lá lốt .......................................................................................................... 37 2.6.10 Sống đời ................................................................................................... 37 2.6.11 Húng chanh .............................................................................................. 38 2.6.12 Thù lù cạnh ............................................................................................... 39 2.6.13 Ngãi cứu ................................................................................................... 40 2.6.14 Tía tô ........................................................................................................ 41 vi 2.6.15 Trầu không ............................................................................................... 41 2.7 Các nghiên cứu kích kháng bệnh cháy bìa lá .................................................... 42 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 44 3.1 Phương tiện ........................................................................................................ 44 3.1.1 Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................... 44 3.1.2 Nguyên vật liệu .......................................................................................... 44 3.1.3 Hóa chất ..................................................................................................... 45 3.2 Phương pháp ...................................................................................................... 46 3.2.1 Tuyển chọn dịch trích thực vật ................................................................... 46 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các loại dịch trích thực vật ....................................................................................... 46 3.2.3 Khảo sát khả năng giảm bệnh cháy bìa lá của các loại dịch trích thực vật 47 3.2.4 Xác định cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá của các loại dịch trích thực vật ............................................................................................................... 47 3.2.4.1 Khảo sát hoạt tính enzyme peroxidase ............................................ 49 3.2.4.2 Khảo sát hoạt tính enzyme catalase ................................................. 49 3.2.4.3 Khảo sát hoạt tính enzyme polyphenol oxidase .............................. 49 3.2.4.4 Khảo sát hoạt tính enzyme phenylalanine ammonia lyase .............. 50 3.2.5 Đánh giá hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá của dịch trích sống đời ............. 50 3.2.6 Xác định loài của cây sống đời sử dụng trong nghiên cứu ........................ 50 3.2.6.1 Ly trích và tinh sạch DNA cây sống đời ......................................... 51 3.2.6.2 Thực hiện phản ứng PCR và điện di ............................................... 51 3.2.6.3 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA .............................. 51 3.2.7 Điều chế cao tổng sống đời bằng các dung môi hữu cơ ............................ 52 3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các loại cao tổng sống đời ........................................................................................ 53 2.2.9 Khảo sát khả năng giảm bệnh cháy bìa lá của các loại cao tổng sống đời 53 2.2.10 Xác định cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá của cao tổng sống đời ...... 54 3.2.11 Đánh giá hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá của cao tổng sống đời trích ly bằng dung môi methanol ............................................................................ 54 3.2.12 Điều chế cao phân đoạn từ cao tổng sống đời trích ly bằng dung môi methanol ..................................................................................................... 55 vii 3.2.13 Khảo sát ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các cao phân đoạn.................................................................................................... 56 2.2.14 Khảo sát khả năng giảm bệnh cháy bìa lá lúa của các loại cao phân đoạn57 2.2.15 Xác định cơ chế kích kháng bệnh cháy bìa lá của cao phân đoạn ........... 57 3.2.16 Đánh giá hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá của cao phân đoạn F3 ............ 58 2.2.17 Xác định các hợp chất trong sống đời có khả năng kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa ..................................................................................................... 58 2.2.18 Khảo sát ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các hợp chất thương mại thay thế cho hợp chất sinh học ly trích từ lá sống đời ..... 59 2.2.19 Khảo sát khả năng và hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá của hỗn hợp 2 hợp chất thương mại FDME và DEHP.............................................................. 61 3.2.20 Khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch 61 3.2.21 Xử lý số liệu ............................................................................................. 62 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 63 4.1 Tuyển chọn dịch trích thực vật .......................................................................... 63 4.2 Ảnh hưởng khả năng nảy mầm và phát triển hạt lúa của các lo