Luận án Nghiên cứu màng bao kết hợp vi khuẩn phân giải lân tạo thành bón vô cơ tan chậm sử dụng cho cây trồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ******************* BÙI ĐOÀN PHƯỢNG LINH NGHIÊN CỨU MÀNG BAO KẾT HỢP VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN TẠO PHÂN BÓN VÔ CƠ TAN CHẬM SỬ DỤNG CHO CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ******************* BÙI ĐOÀN PHƯỢNG LINH NGHIÊN CỨU MÀNG BAO KẾT HỢP VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN TẠO PHÂN BÓN VÔ CƠ TAN CHẬM SỬ DỤNG CHO CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Huỳnh Thanh Hùng TS. Nguyễn Ngọc Hà Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2023 i LỜI CẢM ƠN Bằng sự nỗ lực, cố gắng hết mình của bản thân cùng với sự hướng dẫn, góp ý, chia sẻ, động viên, khích lệ của người thân, bạn bè, đồng nghiệp và đặc biệt là Quý Thầy Cô, luận án của tôi đã được hoàn thành. Tôi xin chân thành cảm ơn: - PGS. TS. Huỳnh Thanh Hùng và TS. Nguyễn Ngọc Hà đã tận tình hướng dẫn, định hướng, truyền đạt kinh nghiệm và kiến thức, giúp đỡ cho tôi từ lúc bắt đầu cho đến khi hoàn thành luận án; - PGS.TS. Lê Đình Đôn và TS. Nguyễn Vũ Phong đã động viên, hỗ trợ nhiệt tình về chuyên môn; - Ban Giám hiệu Trường đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Tập thể Quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Khoa Khoa học Sinh học, Phòng Đào tạo Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập; - PGS.TS. Lê Quang Luân đã quan tâm, góp ý xây dựng và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện một số nội dung luận án tại Phòng Công nghệ Sinh học Vật liệu và Nano – Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh; - Ban Lãnh đạo Công ty cổ phần Phân bón Dầu khí Cà Mau đã giúp đỡ và tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi để thực hiện một số nội dung của luận án; - Ban Giám hiệu và các đồng nghiệp Trường đại học Đồng Nai đã tạo mọi điều kiện, thời gian cho tôi đi học; - Quý Thầy Cô các hội đồng khoa học trong suốt quá trình học tập của tôi đã nhiệt tình phân tích, góp ý, định hướng để giúp tôi hoàn thành luận án; - Một số sinh viên của Trường đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và Trường đại học Đồng Nai kết hợp cùng thực hiện với tôi một số nội dung của luận án; ii - Các anh chị, các bạn và các em làm việc tại phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Công ty cổ phần Phân bón Dầu Khí Cà Mau đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành luận án; - Ba mẹ, ông xã và anh chị em trong gia đình đã luôn ủng hộ, hỗ trợ, nâng đỡ cả về vật chất và tinh thần trong suốt thời gian tôi đi học và thực hiện luận án. Nghiên cứu sinh Bùi Đoàn Phượng Linh iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Huỳnh Thanh Hùng và TS. Nguyễn Ngọc Hà. Kết quả báo cáo trong luận án này là trung thực và chưa từng được công bố trong thời gian trước đây bởi tác giả khác. Nghiên cứu sinh Bùi Đoàn Phượng Linh iv TÓM TẮT Sự kết hợp giữa khả năng phóng thích chất dinh dưỡng chậm với hoạt động của vi sinh vật trong một sản phẩm phân bón là một giải pháp góp phần tăng hiệu suất sử dụng phân bón và hạn chế tác động của phân bón tới môi trường. Mục tiêu của nghiên cứu là chế tạo được phân vô cơ tan chậm với vỏ bọc tạo bởi polymer phân hủy sinh học có kết hợp vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan và bước đầu thử nghiệm hiệu quả trên cây trồng cạn ở điều kiện nhà lưới. Để giải quyết mục tiêu trên, qua tìm hiểu về lý thuyết, các kết quả nghiên cứu thực nghiệm của các công trình nghiên cứu trước liên quan tới vi sinh vật, phân bón, polymer phân hủy sinh học, thử nghiệm phân bón trên cây trồng đã được thực hiện. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 60 chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa lân vô cơ khó tan, trong đó có 3 chủng vi khuẩn có khả năng chịu được nồng độ muối cao. Trên môi trường PVK bổ sung 3% và 4% NaCl chỉ có chủng vi khuẩn PSM54 xuất hiện vòng phân giải lân. Kết quả định danh hai chủng vi khuẩn được lựa chọn để thực hiện các khảo sát trong nghiên cứu là chủng vi khuẩn PSM57 là Burkholderia silvatlantica và chủng PSM54 là Bacillus velezensis. Thời gian nhân sinh khối tối ưu để thu được mật số vi khuẩn cao nhất đối với cả 2 chủng vi khuẩn PSM54 và chủng vi khuẩn PSM57 là 48 giờ. Mặt khác, đề tài cũng đã xác định được phương pháp tạo vi hạt cố định vi khuẩn bằng phương pháp nhốt với sodium alginate 1% và calcium chloride 1% là nồng độ tối ưu tạo vi hạt có kích thước thích hợp nhằm cố định vi khuẩn vào màng bao polymer dùng để tạo màng cho phân tan chậm kết hợp vi khuẩn. Khả năng bảo vệ vi khuẩn của các vi hạt cố định trên màng polymer giúp bảo vệ vi khuẩn trước điều kiện bất lợi của môi trường bên ngoài dựa trên kết quả nuôi cấy vi khuẩn tự do và vi khuẩn cố định trong vi hạt trên môi trường chứa chitosan cũng đã được chứng minh. Đề tài cũng đã xác định được vật liệu phân hủy sinh học chính để làm màng bao phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân là polyurethane, bentonite, CMC, PVA, paraffin và sodium alginate. Phân tan chậm được tạo ra nhờ lớp vỏ bọc là các polymer phân hủy sinh học có bổ sung chủng vi khuẩn PSM54 thỏa mãn tiêu chuẩn về phân tan chậm theo quy định của AAPFCO (Association of American Plant Food Control v Officials) (1997). Kết quả khảo sát cho thấy sau 60 ngày được cố định trong màng bao, chủng vi khuẩn PSM54 vẫn sống và mật số vi khuẩn trên màng bao đạt 88,3% so với mật số ban đầu. Đồng thời, đề tài cũng đã thử nghiệm phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân tạo được trên cây trồng cạn là cây đậu phộng trong điều kiện nhà lưới. Kết quả bước đầu cho thấy phân có ảnh hưởng tốt tới sự phát triển chiều cao cây, số cành trên cây, khả năng hình thành nốt sần và các yếu tố cấu thành năng suất của cây đậu phộng. Khi sử dụng công thức phân bón với lượng phân tan chậm chỉ bằng 60% - 80% so với lượng phân bón thông thường thử nghiệm trên cây đậu phộng vẫn cho hiệu quả tương đương. Từ khóa: cố định vi khuẩn, phân vô cơ tan chậm, polymer phân hủy sinh học, vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan. vi SUMMARY The combination of slow nutrient release with microbial activity in a fertilizer product could increase the fertilizer’s efficiency and limit the impact of chemical hazar of fertilizer on the environment. The research aims are to create controlled release inorganic fertilizer with a membrane made of biodegradable polymers combined with insoluble inorganic phosphate solubilizing bacteria and test its effectiveness on upland plants under greenhouse conditions. To solve the above goal, through learning about theory, experimental research results of previous studies related to microorganisms, fertilizers, biodegradable polymers, testing fertilizers on plants was done. Of sixty insoluble inorganic phosphate solubilizing bacteria strains were isolated from soil samples, there are three strains of bacteria that have both phosphate solubilizing activity and salt tolerance. The analysis results on PVK meidum supplemented with 3% and 4% NaCl showed that only PSM54 strain had phosphorus-degrading ring. The results identified two bacterial strains selected for the analysis, the PSM57 strain Burkholderia silvatlantica and the PSM54 strain Bacillus velezensis. The best time for both PSM54 and PSM57 strains to yield the most biomass multiplication and obtain the highest concentration of bacteria was 48 hours. On the other hand, the results showed that the method to create immobilized microparticles by confinement method using soldium alginate 1% and calcium chloride 1% are the optimal concentrations for the process of creating microparticles with suitable sizes for the purpose of immobilization bacteria into polymeric membranes used to create membranes for controlled realese fertilizers incorporated microorganisms. The thesis identified the ability to protect bacteria from microparticles immobilized on polymer membranes to help protect bacteria against adverse environmental conditions on the results of the culture of free bacteria and immobilized bacteria in bacteria on medium containing chitosan. The polyurethane, bentonite, CMC, PVA, paraffin and sodium alginate were the biodegradable vii materials that selected for preparing controlled release fertilizers coating membranes combined with microorganisms. The controlled release fertilizer was made by coating of biodegradable polymers incorporated PSM54 bacteria that meets standards for slow dissolution according to AAPFCO (Association of American Plant Food Control Officials) (1997). After 60 days incorporated on the membrane of controlled release, the PSM54 bacteria remained at 88,3 % compared to the initial density. In addition, the results of the experimental application of controlled release fertilizer combined with microorganisms on potted peanuts showed that when using controlled release fertilizer in combination with microorganisms, affected the growth of plant height, number of branches per tree, nodulation, and yield components of peanut. Using controlled release fertilizer with the amount of fertilizer only 60% - 80% compared to the amount of normal fertilizer, it also had the same effect on the peanuts. Keywords: bacterial immobilization, biodegradable polymers, controlled release inorganic fertiliezer, insoluble inorganic phosphate solubilizing bacteria. viii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn ..................................................................................................................... i Lời cam đoan ................................................................................................................ iii Tóm tắt ......................................................................................................................... iv Summary ...................................................................................................................... vi Mục lục ....................................................................................................................... viii Danh sách chữ viết tắt ................................................................................................ xiv Danh sách các bảng ..................................................................................................... xv Danh sách các hình .................................................................................................... xvii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 01 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 01 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ............................................................................... 02 3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 02 4. Đối tượng nghiên cứu của đề tài ............................................................................ 03 5. Giới hạn phạm vi nghiên cứu của đề tài.................................................................. 03 6. Nội dung nghiên cứu của đề tài ............................................................................... 03 7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................ 04 8. Tính mới của luận án ............................................................................................... 04 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 05 1.1. Phân bón vô cơ ..................................................................................................... 05 1.1.1. Khái niệm và đặc điểm của phân bón vô cơ ..................................................... 05 1.1.2.Tính tan và yêu cầu của phân bón vô cơ ............................................................ 06 1.1.3. Phân loại phân bón vô cơ ................................................................................. 06 1.1.4. Tác động của việc sử dụng phân bón vô cơ đến môi trường và sức khỏe ........ 07 1.2. Polymer phân hủy sinh học sử dụng làm màng bao phân bón ............................ 08 1.2.1. Phân hủy sinh học và polymer phân hủy sinh học ............................................ 08 1.2.2. Phân loại polymer phân hủy sinh học sử dụng làm màng bao phân tan chậm ............ 09 1.2.2.1. Polymer tự nhiên hoặc polymer tự nhiên đã được cải biến .......................... 09 ix 1.2.2.2. Phức hợp các polymer tự nhiên ..................................................................... 10 1.2.2.3. Polymer tổng hợp có nguồn gốc sinh học hoặc tự nhiên .............................. 10 1.2.2.4. Phức hợp của polymer tổng hợp và polymer tự nhiên .................................. 10 1.2.2.5. Hỗn hợp các hydrocarbon tự nhiên ................................................................ 11 1.2.2.6. Polymer tổng hợp từ phức hợp các hydrocarbon tự nhiên ............................ 11 1.3. Lân trong đất và vi sinh vật phân giải lân ........................................................... 11 1.3.1. Các dạng lân trong đất và vai trò của lân đối với cây trồng ............................. 11 1.3.2. Vai trò của vi sinh vật phân giải lân .................................................................. 12 1.3.3. Sự chuyển hóa lân hữu cơ nhờ vi sinh vật ........................................................ 13 1.3.4. Sự chuyển hóa lân vô cơ nhờ vi sinh vật .......................................................... 14 1.4. Tổng quan về cố định tế bào vi sinh vật .............................................................. 15 1.4.1. Các phương pháp cố định tế bào ....................................................................... 15 1.4.1.1. Phương pháp cố định tế bào trên bề mặt chất mang rắn ................................ 16 1.4.1.2. Phương pháp cố định tế bào bằng cách nhốt tế bào trong gel ....................... 16 1.4.1.3. Phương pháp cố định tế bào bằng cách keo tụ tế bào .................................... 17 1.4.1.4. Phương pháp cố định tế bào bằng cách nhốt tế bào trong hệ sợi ................... 17 1.4.1.5. Phương pháp cố định tế bào bằng cách tạo vi nang ....................................... 17 1.4.2. Ưu, nhược điểm của tế bào cố định .................................................................. 18 1.5. Phân bón tan chậm ............................................................................................... 18 1.5.1. Khái niệm .......................................................................................................... 18 1.5.2. Ưu điểm và nhược điểm của phân bón tan chậm .............................................. 19 1.5.3. Phân biệt một số loại phân bón tan chậm .......................................................... 19 1.5.4. Phân bọc tan chậm (CRFs) ............................................................................... 20 1.5.4.1. Cấu tạo phân bọc tan chậm và cơ chế phóng thích chất dinh dưỡng của phân bọc tan chậm ............................................................................................................... 20 1.5.4.2. Tiêu chí đánh giá phân bọc tan chậm ............................................................ 21 1.6. Tổng quan về các nguyên liệu chính dùng tổng hợp màng bao phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân phân ................................................................................. 21 1.6.1. Polyvinyl alcohol (PVA) ................................................................................... 21 x 1.6.2. Carboxylmethyl cellulose (CMC) ..................................................................... 22 1.6.3. Bentonite ........................................................................................................... 23 1.6.4. Alginate ............................................................................................................. 23 1.6.5. Polyurethane ...................................................................................................... 23 1.7. Tình hình nghiên cứu phân bón tan chậm và phân bón tan chậm kết hợp vi sinh vật . 24 1.7.1. Tình hình nghiên cứu phân bón tan chậm và phân bón tan chậm kết hợp vi sinh vật ở trên thế giới ........................................................................................................ 24 1.7.2. Tình hình nghiên cứu phân bón tan chậm và phân bón tan chậm kết hợp vi sinh vật ở Việt Nam ............................................................................................................ 30 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 34 2.1. Vật liệu ................................................................................................................. 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 34 2.2.1. Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan và khảo sát điều kiện tối ưu tạo vi hạt calcium sodium alginate ................................ 34 2.2.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải lân từ đất trên môi trường thạch đĩa ...................................................................................................................... 34 2.2.1.2. Định danh chủng vi khuẩn ............................................................................. 35 2.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến kích thước vi hạt calcium sodium alginate .............................................................................................. 36 2.2.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calcium chloride đến kích thước vi hạt calcium sodium alginate .............................................................................................. 37 2.2.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng phân tử sodium alginate đến kích thước vi hạt calcium sodium alginate .................................................................................... 37 2.2.2. Nội dung 2: Tổng hợp màng polymer phân hủy sinh học ................................ 38 2.2.2.1. Tạo màng PVA và màng CMC ...................................................................... 38 2.2.2.2. Tạo màng polymer bởi sự kết hợp giữa CMC với PVA, urea và glycerol.. .. 38 2.2.2.3. Khảo sát khả năng phân hủy sinh học của màng tạo bởi CMC kết hợp với PVA, urea và glycerol ................................................................................................ 40 xi 2.2.2.4. Khảo sát mức độ hấp thụ nước của màng CMC kết hợp với PVA, urea và glycerol chứa và không chứa vi hạt calcium sodium alginate .................................... 40 2.2.3. Nội dung 3: Cố định vi khuẩn phân giải lân trong vi hạt calcium sodium alginate ........................................................................................................................ 41 2.2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến nhân sinh khối vi khuẩn ..... 41 2.2.3.2. Cố định tế bào vi khuẩn phân giải lân và và xác định mật số vi khuẩn trong vi hạt calcium sodium alginate ........................................................................................ 42 2.2.3.3. Xác định hoạt tính phân giải lân của vi khuẩn được cố định trong vi hạt calcium sodium alginate .............................................................................................. 43 2.2.3.4. Khảo sát khả năng tạo màng của chitosan và khả năng bảo vệ vi khuẩn trong vi hạ