Luận án Nghiên cứu một số cơ sở khoa học để gây trồng và phát triển cây mật nhân (eurycoma longifolia jack) tại vùng nam trung bộ và Tây Nguyên

26 Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu Đề tài đặt ra các nội dung nghiên cứu sau đây: - Nghiên cứu bổ sung đặc điểm sinh học cây Mật nhân ở vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên + Đặc điểm phân bố và sinh thái; + Đặc điểm vật hậu; + Đặc điểm cấu trúc và tái sinh các lâm phần có Mật nhân phân bố. - Nghiên cứu đặc điểm đa dạng di truyền và giá trị nguồn gen cây Mật nhân tại các tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên + Đặc điểm đa dạng di truyền. + Giá trị nguồn gen. - Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Mật nhân ở vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên + Đặc điểm sinh lý hạt giống. + Nhân giống hữu tính. + Nhân giống vô tính bằng phương pháp giâm hom. - Nghiên cứu kỹ thuật trồng cây Mật nhân ở vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên + Ảnh hưởng của phương thức trồng đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của Mật nhân; + Ảnh hưởng của mật độ trồng đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của Mật nhân; + Ảnh hưởng của phân bón đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của Mật nhân; + Ảnh hưởng của kỹ thuật làm đất đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của Mật nhân. - Nghiên cứu kỹ thuật thu hoạch, sơ chế và bảo quản Mật nhân + Kỹ thuật thu hoạch; + Kỹ thuật sơ chế và bảo quản. 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng 2.2.1. Cách tiếp cận nghiên cứu Để giải quyết các vấn đề nghiên cứu, đề tài sử dụng các cách tiếp cận sau: - Tiếp cận kế thừa: Luận án kế thừa các thông tin, số liệu về điều kiện tự nhiên khu vực nghiên cứu và các kết quả nghiên cứu đã có liên quan đến Mật nhân. - Tiếp cận hệ thống: Nghiên cứu được triển khai với cách tiếp cận hệ thống từ nghiên cứu bổ sung các đặc điểm sinh học (phân bố, sinh thái), đặc điểm đa dạng di truyền và giá trị nguồn gen Mật nhân cho đến kỹ thuật nhân giống và trồng Mật nhân theo trình tự logic và kế hoạch thống nhất. - Tiếp cận có sự tham gia: Việc điều tra, đánh giá đặc điểm phân bố, sinh thái, giá trị sử dụng, gây trồng cây Mật nhân có sự tham gia cộng tác và cung cấp thông tin của các bên hữu quan, đặc biệt là của người dân, cán bộ địa phương và các đơn vị phối hợp nghiên cứu nhằm đảm bảo tính khách quan và độ chính xác của kết quả nghiên cứu, thông qua đó kết hợp chuyển giao kết quả nghiên cứu vào sản xuất. Các mẫu Mật nhân được thu hái từ tự nhiên được phân tích trong phòng thí nghiệm để xác định hàm lượng dược chất và phân tích đa dạng di truyền, trên cơ sở đó lựa chọn các xuất xứ có hàm lượng dược chất cao để tuyển chọn cây trội, làm nguồn vật liệu nhân giống, gây trồng, bảo tồn và phát triển. Do vậy, cần huy động nguồn lực của nhiều bên tham gia để phối hợp triển khai các nội dung/công việc nghiên cứu trong quá trình thực hiện. - Tiếp cận theo hướng bảo tồn tự nhiên và vùng sinh thái: xuất phát từ đặc điểm phân bố tự nhiên và đặc tính sinh thái loài cây Mật nhân đã thích nghi qua quá trình chọn lọc tự nhiên để xây dựng các mô hình trồng thử nghiệm bằng các biện pháp kỹ thuật gần với sinh cảnh tự nhiên và ít tác động vào tài nguyên rừng, trên cơ sở kết quả mô phỏng tự nhiên xây dựng các quy trình, hướng dẫn nhân giống, trồng, chăm sóc. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và đa dạng nguồn gen cây Mật nhân 2.2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm phân bố và sinh thái 28 - Phương pháp điều tra, khảo sát theo tuyến: Trên cơ sở thông tin thu thập được, kết hợp với kế thừa các tài liệu có sẵn và tham vấn các cán bộ cơ sở và người dân tại mỗi địa phương xác định sơ bộ các khu vực ghi nhận có cây Mật nhân phân bố nhiều, đề tài thiết lập 49 tuyến điều tra đại diện cho các dạng lập địa, vùng sinh thái (vùng cát ven biển, rừng phục hồi sau nương rẫy, rừng lá rộng thường xanh, rừng khộp, ) và các đai cao (dưới 500m; 500 – 1.000m, và trên 1.000m) tại 13 tỉnh vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên (chi tiết các tuyến tra tại phụ lục 1). Tại các tuyến điều tra, nơi bắt gặp loài Mật nhân phân bố tiến hành mô tả và ghi chép các đặc điểm lập địa như đặc điểm địa hình, độ cao so với mực nước biển bằng GPS, độ dốc bằng thước đo độ dốc, hướng dốc,.... Thu thập thông tin về khí hậu (gồm nhiệt độ tối cao, nhiệt độ tối thấp, nhiệt độ trung bình năm, lượng mưa trung bình năm, độ ẩm không khí trung bình năm, v.v.) thông qua 13 trạm đo khí tượng gần nhất tại mỗi địa phương trong 3 năm gần nhất. Tại mỗi tỉnh đào 2 phẫu diện điển hình nơi có loài Mật nhân phân bố tập trung để mô tả và thu thập mẫu đất, khối lượng 01kg ở độ sâu 30cm. Bảng 2.1. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu lý, hóa tính đất Chỉ tiêu Phương pháp TT Đơn vị phân tích phân tích 1 pH KCl TCVN 5979:2007 2 OM % TCVN 8941:2011 3 N tsố % TCVN 6498: 1999 4 Ndễ tiêu mg N /100g TCVN 5255:2000 5 P2O5 tsố % TCVN 8940:2011 6 P2O5 dễ tiêu mg P2O5 /100g TCVN 5256:2009 8 K2Odễ tiêu mg K2O/100g TCVN 8662:2010 9 Thành phần cơ giới - TCVN 8567:2010 10 Ca2+ meq/100 g đất TCVN 8569:2010 11 Mg2+ meq/100 g đất TCVN 8569:2010 Mẫu đất được gửi về phân tích tại phòng thí nghiệm đất Viện khoa học nông nghiệp Tây Nguyên (Eakmat). 29 2.2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm vật hậu Chọn chọn 3 cây đại diện/điểm quan sát để theo dõi tại vùng Nam Trung Bộ (Bình Định, Khánh Hòa và Phú Yên) và vùng Tây Nguyên (Gia Lai và Kon Tum). Tổng số cây quan sát là 15 cây. Cây theo dõi là cây trưởng thành đã ra hoa, kết quả; đại diện nhất cho các cá thể Mật nhân trong lâm phần, có hình thái thân đẹp, thẳng, tán lá đều, khoẻ mạnh, không sâu bệnh hại. Tiến hành quan sát, theo dõi thời điểm nảy chồi, ra hoa, kết quả, thời điểm quả chín và quả chín rộ. Thời gian theo dõi 2 năm (2019-2020), 10 ngày theo dõi một lần. Thu hái toàn bộ quả trên cây mẫu, để xác định sản lượng quả 2 vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên. 2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và tái sinh các lâm phần nơi có loài Mật nhân phân bố Tại 5 tỉnh: Gia Lai, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Kon Tum lập 45 ô tiêu chuẩn (ÔTC) tạm thời, có kích thước 2.500m 2/OTC (50m x 50m), mỗi tỉnh lập 9 ô tiêu chuẩn đại diện cho 3 trạng thái rừng (giàu, trung bình và nghèo) theo Thông tư số 33/2018/TT-BNNPTNT ngày 16/11/2018 của (Bộ NN&PTNT, 2018) (03 ÔTC/1 trạng thái). Mỗi trạng thái lập 3 ÔTC theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng không theo tỷ lệ. Trong các ÔTC tiến hành hành đo đếm các chỉ tiêu: Định danh các loài cây, D1,3, Hvn của tất cả các cây có D 1,3 ≥ 6cm, bao gồm cả loài Mật nhân. Đường kính ngang ngực: dùng thước dây đo chu vi (đo vanh) tại vị trí 1,3m của chiều cao cây tính từ mặt đất, độ chính xác đến 0,1cm; chiều cao cây đo bằng thước đo cao Blume-Leisse kết hợp thước sào có khắc vạch, có độ chính xác đến 0,1m. - Trong mỗi ÔTC lập 5 ô dạng bản diện tích 4m 2 (2 x 2m) để điều tra cây tái sinh (01 ở tâm, 4 ô ở 4 góc của ÔTC). Tiến hành thu thập các chỉ tiêu: tên loài, chiều cao cây tái sinh của tất cả các cây có D1,3< 6cm. 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm đặc điểm đa dạng di truyền và giá trị nguồn gen Mật nhân tại các tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên 2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm đa dạng di truyền * Thu thập mẫu: 30 - Mẫu phân tích ADN là mẫu lá được thu thập tại 26 quần xã nơi có loài Mật nhân phân bố tập trung (đã được định vị) thuộc 13 tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên. Cây được lấy mẫu lá đại diện cho quần xã, sinh trưởng trung bình, không bị sâu bệnh, không bị chèn ép về không gian dinh dưỡng và được lấy từ những cây trội Mật nhân đã được tuyển chọn. Tổng số mẫu phân tích ADN là 100 mẫu lá từ 100 cây trội Mật nhân đã được tuyển chọn từ 26 quần xã có Mật nhân phân bố tại 13 tỉnh vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên được tổng hợp chi tiết tại Phụ lục 2. - Mỗi mẫu thu hái 3 - 5 lá, lá thu hái là các lá bánh tẻ. - Mẫu sau khi thu hái được cho vào túi nilon có dây kéo bịt kín và có gel hút ẩm, đựng trong thùng xốp và gửi ngay về phòng thí nghiệm Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp trong thời gian 48 giờ để xử lý. * Đánh giá đa dạng di truyền: - Tách DNA tổng số theo phương pháp CTAB của Doyle JJ. và Doyle JL.(1987) có cải tiến một số bước, cụ thể như sau: + Mỗi mẫu lá lấy 200mg, nghiền mịn bằng nitơ lỏng, đựng trong ống eppendorf 2 ml. + Bổ sung 700µl đệm chiết (EDTA 0,5M pH8, 100mM Tris HCl pH8, 500mM NaCl, 2% CTAB, 2% PVP và 0,1% β-mecaptoethanol). + Tiến hành ủ hỗn hợp dịch chiết và mẫu ở nhiệt độ 65oC trong vòng 60 phút. + Quay ly tâm với tốc độ 20.000 vòng/phút trong thời gian10 phút. + Dùng pipet hút phần dịch sang ống eppendorf 2ml mới và bổ sung 30µl Rnase rồi ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37oC. + Tiếp tục bổ sung 700µl Chlorofom:Isoamyalcohol (tỷ lệ thể tích 24:1), lắc đều và quay ly tâm 20.000 vòng/phút trong 10 phút. + Tiếp tục ủ ở -20 oC trong 30 phút, ly tâm 20.000 vòng/phút trong 10 phút rồi thu tủa ADN. + Rửa tủa bằng Ethanol 70o lạnh kết hợp với ly tâm. + Để ADN ở nhiệt độ phòng trong 5 phút rồi hòa tan bằng 100µl đệm 1x TE và bảo quản trong tủ lạnh -20oC. 31 - ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% và quan sát bằng máy soi gel sử dụng tia UV. - Đo nồng độ ADN tổng số được xác định bằng máy đo quang phổ hấp thụ Nano drop. + Kỹ thuật PCR với mồi ISSR được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ) theo chu trình phương pháp của Wu và cộng sự (2014): Bảng 2.2. Tên các mồi ISSR Số TT Tên mồi ISSR Trình tự mồi (5’-3’) 1 UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 2 UBC808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 3 UBC809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 4 UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 5 UBC811 GAGAGAGAGAGA GAGAC 6 UBC818 CACACACACACA CACAG 7 UBC823 TGTGTGTGTGTGTGTGGA 8 UBC824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 9 UBC827 ACACACACACACACACG 10 UBC828 TGTGTGTGTGTGTGTGA AND của các mẫu nghiên cứu được khuếch đại bằng các mồi ISSR với các thành phần phản ứng và điều kiện của phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR- Polymerase Chain Reaction) được mô tả ở Bảng 2.3 và Bảng 2.4: Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ sử Thể tích phản phản ứng dụng ứng dH2O 6 μl PCR master mix 2X 10 μl DNA 20 ng/µl 3 μl Mồi ISSR 10 µM 1 μl Tổng thể tích 20 μl 32 Bảng 2.4. Chu trình phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 4 phút 1 2 Biến tính 94 45 giây 35 3 Gắn mồi 56 40 giây 4 Kéo dài chuỗi 72 45 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 5 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 12 ∞ Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 2% trong dung dịch đệm 1x TAE được nhuộm bằng Redsafe với tỷ lệ thể tích 5µl/100ml đệm, chạy ở hiệu điện thế 90V trong vòng 70 phút. Kích thước các băng được so sánh theo thang ADN chuẩn 1kb (Thermo Scientific) và quan sát bằng máy soi gel sử dụng tia UV. - Phân tích số liệu bằng chương trình NTSYSpc version 2.0 theo quy ước: 1 = phân đoạn ADN xuất hiện và 0 = phân đoạn ADN không xuất hiện khi điện di sản phẩm PCR. + Phân loại mẫu nghiên cứu dựa trên hệ số tương đồng: sau khi các mẫu nghiên cứu được phân tích kiểu gen sẽ tính được hệ số tương đồng di truyền và xác định biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS. Việc phân loại mẫu nghiên cứu bằng phân tích PCoA (Principal Coordiante Analysis) qua việc xây dựng biểu đồ phân nhóm 2 chiều qua đó lập bản đồ phân nhóm dựa trên khoảng cách di truyền giữa các xuất xứ nghiên cứu bằng phần mềm GelAlex. + Lập biểu đồ hình cây để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu theo phương pháp Nei và Li (1979) bằng phần mềm MEGA X. 2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm giá trị nguồn gen * Giá trị nguồn gen Tiến hành điều tra thực trạng khai thác và giá trị sử dụng cây Mật nhân tại 5 tỉnh với số lượng mỗi huyện 20 phiếu: Gia Lai (Kbang, Mang Yang, Chư Păh), Kon 33 Tum (Tu Mơ Rông, Kon Rẫy), Bình Định (An Lão), Phú Yên (Sông Hinh, Sông Cầu), Quảng Ngãi (Ba Tơ). Tổng số phiếu đã phỏng vấn là 180. Đối tượng phỏng vấn là người dân sống quanh rừng, các thầy lang, các già làng, người thu mua và người buôn bán kinh doanh Mật nhân. Phương pháp điều tra áp dụng là đánh giá nông thôn có sự tham gia (PRA) với công cụ phỏng vấn bán định hướng. Nội dung phỏng vấn bao gồm: i) Mục đích khai thác Mật nhân; ii) Tình hình tiêu thụ (các bộ phận sử dụng, khối lượng; iii) Giá bán; iv) Kiến thức bản địa trong sử dụng dược liệu Mật nhân (tập trung vào các nhóm bài thuốc chữa bệnh từ cây Mật nhân: nhóm chữa bệnh ngoài ra, nhóm tăng cường sức khỏe, nhóm chữa bệnh đường ruột và nhóm khác). * Hàm lượng dược liệu: Trên cơ sở các cây đã lựa chọn đã phân tích đa dạng di truyên, tiến hành lấy mẫu rễ để phân tích một số hàm lượng dược chất chính của Mật nhân. Mỗi mẫu rễ tươi thu hái có khối lượng tối thiểu 600g. Tổng số mẫu thu thập 100 mẫu thu được chuyển về phòng thí nghiệm tiến hành phân tích. - Chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu phân tích: + Mẫu thu thập được xử lý sơ bộ, rửa sạch bằng vòi nước áp lực cao, phơi trong môi trường tự nhiên và bảo quản theo quy định và gửi về phòng phân tích di truyền Viện Công nghệ hóa học - Phân viện Thành phố Hồ Chí Minh bảo quản cắt, xay, tách chiết và phân tích. + Mẫu tươi được bảo quản trong túi lưới, ghi đầy đủ số hiệu mẫu, địa điểm thu mẫu, tọa độ. Bảo quản mẫu trong tủ lạnh nếu mẫu không được chuyển về phòng thí nghiệm trong ngày. - Phương pháp xác định thành phần, tính chất hóa học dược liệu Mật nhân: + Xác định hàm lượng arsen bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử giải phóng hydrua theo TCVN 7770: 2007 (ISO 17239 : 2004): Rau, quả và sản phẩm rau, quả. + Xác định hàm lượng chì bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử theo TCVN 7602: 2007 (AOAC 972.25): Thực phẩm. 34 + Xác định hàm lượng cadmi bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử theo TCVN 7603: 2007 (AOAC 973.34): Thực phẩm. + Xác định hàm lượng thuỷ ngân bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa theo TCVN 7604: 2007 (AOAC 971.21): Thực phẩm. + Phương pháp xác định một số hợp chất chính: Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ phân giải cao (xem mục III, phụ lục 2). Các hợp chất phân tích gồm: 1) hàm lượng saponin tổng; 2) hàm lượng flavonoid tổng; 3) Hàm lượng polyphenol tổng; 4) hàm lượng alkaloid tổng; 5) Định lượng 2 dược chất Eurycomanone và Eurycomanol. 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Mật nhân 2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý hạt giống - Vật liệu nghiên cứu: quả Mật nhân được thu hái trong tự nhiên từ những cây trội đã được tuyển chọn. Trên mỗi cây trội đã chọn, thu hái quả với khối lượng 1kg/cây/thời điểm thu hái. Quả ở mỗi thời điểm thu hái được trộn đều giữa các cây trội rồi đem làm thí nghiệm xác định thời điểm thu hái đến đặc điểm sinh lý hạt giống. Thí nghiệm được bố trí theo ngỗi ngẫu nhiên đầy đủ, 3 lần nhắc lại. - Thí nghiệm xác định thời điểm thu hái hạt giống đến đặc điểm sinh lý hạt giống Mật nhân + Thời điểm 1 (T1): thu hái khi quả đã phát triển đầy đủ, vỏ quả có màu xanh hoặc hung đỏ, khi bóp nhẹ không bị móp lại; + Thời điểm 2 (T2): thu hái khi vỏ quả chuyển sang màu hung đỏ, mọng nước, khi bóp nhẹ phần vỏ thịt bị móp lại và chảy nước; + Thời điểm 3 (T3): thu hái khi vỏ quả chuyển sang màu nâu thẫm hoặc đen, mọng nước; + Thời điểm 4 (T4): thu hái khi vỏ thịt quả màu đen khô lại, bám lấy phần hạt, một số hạt đã khô rụng xuống đất. - Sơ chế: quả thu hái về được ủ 3 ngày để lớp vỏ thịt mềm, dễ loại bỏ phần vỏ ngoài. 35 - Độ thuần (độ sạch) hạt giống: mỗi mẫu lấy 1kg hạt, rút theo phương pháp đối góc - trải mẫu hạt lên bản gỗ phẳng dàn đều mẫu thành một lớp mỏng hình vuông, dùng thước kẻ mỏng dàn gạch 2 đường chéo góc cho hình vuông. Hợp 2 phần góc đối lập thành 2 mẫu mới (Bộ KH&CN, 2011). Mẫu phân tích độ thuần được chia thành 3 thành phần: hạt thuần, tạp chất và các loại khác. Dùng cân điện tử có độ chính xác 0,01g cân từng phần. - Khối lượng 1.000 hạt: mỗi mẫu lấy ngẫu nhiên 1.000 hạt, 3 lần lặp lại. Dùng cân điện tử có độ chính xác 0,01g cân khối lượng. Tính trung bình khối lượng 3 lần lặp. - Độ ẩm ban đầu của hạt: được xác định bằng cách rút ngẫu nhiên 100 hạt ngay sau khi sơ chế theo 4 công thức thời điểm thu hái quả khác nhau, với 3 lần lặp, dùng cân điện tử cân riêng từng mẫu hạt trước và sau khi sấy khô ở nhiệt độ 105 0 trong thời gian 17-18 giờ đến khi khối lượng ổn định, rồi để nguội hạt trong môi trường cách ẩm silicagen trong 30 phút rồi cân để xác định khối lượng hạt sau khi sấy. Xác định độ ẩm ban đầu bằng cách tính phần trăm khối lượng chênh lệch khối lượng hạt trước và sau khi sấy. 2.2.4.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân giống hữu tính - Vật liệu nghiên cứu: Hạt Mật nhân được thu hái trong tự nhiên từ những cây trội đã được tuyển chọn. Thu hái khi vỏ quả đã chuyển sang màu nâu thẫm hoặc đen, mọng nước. - Địa điểm nghiên cứu: Vườn ươm Trung tâm Lâm nghiệp Nhiệt đới, phường Chi Lăng, thành phố Pleiku, tỉnh Gia Lai. - Các yếu tố không thí nghiệm được áp dụng đồng nhất ở tất cả các CTTN (từ thí nghiệm 2 đến thí nghiệm 5), bao gồm: cây được ươm trong bầu PE, kích thước 8 cm x 12 cm (Không áp dụng đối với thí nghiệm 3), đục 6 - 8 lỗ xung quanh, thành phần ruột bầu đồng nhất gồm 75% đất mặt + 25% xơ dừa (không áp dụng đối với thí nghiệm 2); mức che sáng từ 50 - 55% (không áp dụng đối với thí nghiệm 4); tưới phân chuồng ngâm trong quá trình chăm sóc (không áp dụng đối với thí nghiệm 5). - Chăm sóc cây con: tưới nước sạch vào sáng sớm hoặc chiều mát. Hai tháng 36 đầu tưới 2 lần/ngày, sau đó giảm dần lượng nước tưới. Thời tiết khô nóng cần tăng số lần và lượng nước tưới, không tưới quá nhiều sẽ gây úng, thối rễ. Làm cỏ phá váng 15 - 20 ngày/lần trong 2 tháng đầu, các tháng sau 1 lần/tháng. + Phòng trừ sâu bệnh hại: khi phát hiện bệnh thì sử dụng thuốc trừ bệnh: Du Pont Equation 52,5 WG và Champion 77 WP. Nếu phát hiện có sâu xanh, sâu cuốn lá hay sâu đục thân, ... cắn phá cây thì sử dụng Sherpa 25 EC, Diazol 50 EW và Tasieu 5.EC luân phiên để tránh kháng thuốc. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp xử lý hạt giống đến tỷ lệ nảy mầm của hạt giống Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên gồm 03 công thức xử lý hạt, mỗi công thức bố trí 3 lần lặp, mỗi lần lặp 100 hạt để kiểm tra tỷ lệ nảy mầm, tổng số hạt thí nghiệm là 900 hạt. - CT1: Ngâm hạt trong nước ở nhiệt độ thường; - CT2: Ngâm hạt trong nước ở nhiệt độ ban đầu 400C; - CT3: Ngâm hạt trong nước ở nhiệt độ ban đầu 600C. Hạt được ngâm trong nước ở các nhiệt độ ban đầu theo các công thức thí nghiệm trên trong khoảng thời gian 12 giờ, sau đó vớt ra, rửa sạch và gieo trong các khay lót giấy ẩm để ở nhiệt độ trong phòng, phủ giấy bao lên để giữ độ ẩm cho hạt. Chỉ tiêu theo dõi: Hàng ngày theo dõi và ghi chép số hạt nảy mầm (hạt nảy mầm được tính khi kích thước mầm nhú ra bằng 1/3 kích thước hạt). Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng cây con Mật nhân trong giai đoạn vườn ươm Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ gồm 04 công thức thành phần ruột bầu khác nhau với tỷ lệ theo thể tích, mỗi công thức 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 cây, tổng số cây thí nghiệm là 360 cây. Túi bầu PE kích thước 8 cm x 12 cm, đục 6 - 8 lỗ xung quanh. - CT1: 75% đất tầng mặt + 25% xơ dừa; - CT2: 50% đất tầng mặt + 25% xơ dừa + 25% trấu hun; - CT3: 20% đất tầng mặt + 40% xơ dừa + 40% trấu hun; 37 - CT4: 100% đất tầng mặt. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước túi bầu đến tỷ lệ sống và sinh trưởng cây con Mật nhân trong giai đoạn vườn ươm Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ gồm 03 công thức kích thước túi bầu khác nhau, mỗi công thức 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 cây. Tổng số cây thí nghiệm là 270 cây. + CT1: kích thước túi bầu 8cm x12cm; + CT2: kích thước túi bầu 10cm x 15cm; + CT3: kích thước túi bầu 15cm x 18cm. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ che sáng đến tỷ lệ sống và sinh trưởng cây con Mật nhân Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ gồm 04 công thức che sáng khác, mỗi công thức 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 cây. - CT1: Không che sáng (đối chứng); - CT2: Che sáng 30%; - CT3: Che sáng 50%; - CT4: Che sáng 70%. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của phân bón đến tỷ lệ sống và sinh trưởng cây con Mật nhân Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ gồm 04 công thức tưới phân khác nhau, mỗi công thức 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 cây. Tổng số cây thí nghiệm là 360 cây. - CT1: Tưới phân NPK (5:10:3) nồng độ 5%; - CT2: Tưới nước phân chuồng ngâm; - CT3: Tưới phân super lân 5%; - CT4: Không tưới phân (đối chứng). * Các chỉ tiêu theo dõi và thời gian đánh giá (áp dụng chung cho thí nghiệm 2, 3, 4 và 5): thời gian theo dõi thí nghiệm 12 tháng, định kỳ đánh giá 3 tháng/lần. Theo dõi các chỉ tiêu về tỷ lệ sống, đường kính cổ rễ, chiều cao cây. 38 2.2.4.3. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính Mật nhân bằng phương pháp giâm hom - Vật liệu nghiên cứu: Hom Mật nhân được thu hái trong tự nhiên từ những cây mẹ sai quả, chất lượng quả tốt. Các yếu tố không thí nghiệm được áp dụng đồng nhất ở tất cả các thí nghiệm nhân giống vô tính mật nhân (bao gồm thí nghiệm 1, 2, 3 và 4), cụ thể: - Chọn, lấy hom (không áp dụng đối với thí nghiệm 2): Hom giâm được thu hái từ cành bánh tẻ và chồi ngọn có chiều dài từ 10 - 15 cm. Lấy hom vào thời điểm cây không có quả. - Thời thời điểm lấy hom: vào lúc sáng sớm hay chiều mát. Hom sau khi thu được đựng trong thùng gỗ cỡ lớn (mỗi thùng không quá 10kg hom), có duy trì độ ẩm đảm bảo khoảng 85%. Hom được che nắng, chống nóng, tránh dập nát trong quá trình vận chuyển hom. - Xử lý hom: Dùng kéo sắc cắt phần gốc hom (1 - 2cm), tránh làm dập và trầy xước. Sau đó cắt 2/3 lá để giảm thoát hơi nước. Hom rửa sạch, ngâm dung dịch diệt nấm bệnh (thuốc tím nồng độ 1g/lít hay Benlat 5%) từ 10 - 15 phút. Rửa lại bằng nước sạch, vớt ra để khoảng 5 phút cho ráo nước và xử lý chất kích thích ra rễ. - Giá thể giâm hom: Giá thể giâm hom là cát sạch 50%, đất 50%, đóng trong bầu PE kích thước 10x15cm, phun thuốc diệt nấm bệnh (Benlat 5%) và thuốc trừ sâu (Sumi alpha) để diệt côn trùng trước khi giâm 5 - 10 ngày. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và nồng độ đến khả năng ra rễ của hom giâm Mật nhân Thí nghiệm được bố trí 2 nhân tố: Nhân tố A là 3 loại chất điều hòa sinh trưởng (NAA, IAA và IBA) và nhân tố B là 4 mức nồng độ (100 ppm, 500 ppm, 1000 ppm và 1500 ppm), tổ hợp có 12 công thức thí nghiệm và 1 công thức đối chứng không xử lý chất điều hòa sinh trưởng, mỗi công thức bố trí 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 hom/công thức/lần lặp. 39 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hom đến tỷ lệ ra rễ của hom Mật nhân Trên cơ sở kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng ở thí nghiệm 1, lựa chọn loại chất điều hòa sinh trưởng và nồng độ thích hợp nhất để áp dụng. Thí nghiệm bố trí 2 loại hom là hom ngọn và hom ngay sát hom ngọn, với 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 hom/công thức/lần lặp. - CT1: Hom ngọn (H1) - CT2: Hom ngay sát hom ngọn (H2). Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ giâm hom đến tỷ lệ ra rễ và sinh trưởng của hom Mật nhân Thí nghiệm bố trí với 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 hom/công thức/lần lặp. - CT1: Trước mùa mưa (tháng 3) - CT2: Giữa mùa mưa (tháng 7) - CT3: Cuối mùa mưa (tháng 9) - CT4: Sau mùa mưa (tháng 11). Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của kỹ thuật tưới nước đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của hom giâm Mật nhân Thí nghiệm bố trí với 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 hom/công thức/lần lặp. CT1: Thời gian tưới (3 giây) CT2: Thời gian tưới (6 giây) CT3: Thời gian tưới (9 giây). * Chỉ tiêu theo dõi: Các chỉ tiêu theo dõi áp dụng như nhau ở các thí nghiệm từ TN1 đến TN4, cụ thể: số hom sống, số hom ra rễ, số chồi/hom, chiều cao chồi ở các thời điểm 15, 30, 60 và 90 ngày; ở thời điểm 90 ngày theo dõi thêm các chỉ tiêu số rễ/hom và chiều dài rễ ở tất cả các CTTN ở cả 3 lần lặp. 2.2.5. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật trồng Mật nhân ở vùng Nam Trung Bộ và Tây Nguyên Các thí nghiệm về các biện pháp kỹ thuật trồng cây Mật nhân được bố trí theo 40 khối ngẫu nhiên đầy đủ, với 3 lần lặp, mỗi lần lặp 180 cây, mỗi công thức thí nghiệm có diện tích 90m2/công thức/lần lặp. Các yếu tố không thí nghiệm được áp dụng như nhau ở tất cả các thí nghiệm, bao gồm: Tiêu chuẩn cây giống đem trồng: cây con Mật nhân được nhân giống bằng hạt từ nguồn hạt của các cây trội đã được tuyển chọn; 15 tháng tuổi, đường kính gốc > 0,3 cm, chiều cao cây từ 12 - 15 cm, có từ 3 - 5 cặp lá, cây khỏe mạnh, không sâu bệnh hại, cong queo hay cụt ngọn. Chăm sóc: Phát dọn thực bì, làm cỏ, vun gốc, phòng trừ sâu bệnh hại định kỳ 2 lần/năm. Bón thúc 0,3 kg NPK/gốc. Thường xuyên theo dõi, bảo vệ các hiện trường thí nghiệm nhằm phòng tránh các tác nhân phá hoại (con người, súc vật), chú trọng công tác phòng chống cháy cho các mô hình thí nghiệm. Các yếu tố thí nghiệm: Mật độ trồng 5.000 cây/ha (1,0 m x 2,0 m) (không áp dụng đối với thí nghiệm ảnh hưởng của mật độ trồng - thí nghiệm 2); trồng thuần loài; kích thước hố trồng 30 x 30 x 30 cm (không áp dụng đối với thí nghiệm ảnh hưởng của kỹ thuật làm đất - thí nghiệm 4); bón lót 3,0 kg phần chuồng hoai mục + 0,1 kg phân hữu cơ vi sinh + 0,1kg NPK/hố (không áp dụng đối với thí nghiệm ảnh hưởng của phân bón - thí nghiệm 3); trồng dưới tán rừng ở độ tàn che 0,3 (không áp dụng đối với thí nghiệm ảnh hưởng của phương thức trồng – thí nghiệm 1); trồng bằng cây con có bầu 15 tháng tuổi (không áp dụng đối với thí nghiệm ảnh hưởng của tuổi cây con đem trồng – thí nghiệm 5). Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức trồng đến tỷ lệ sống và sinh trưởng cây Mật nhân dưới tán rừng Bố trí các công thức thí nghiệm sau: - CT1: Trồng trên đất trống (đối chứng); - CT2: Trồng dưới tán rừng độ tàn che 0,3; - CT3: Trồng dưới tán rừng độ tàn che 0,5; - CT4: Trồng dưới tán rừng độ tàn che 0,7. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ trồng đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây Mật nhân Bố trí 4 công thức thí nghiệm mật độ sau: 41 - CT1: 20.000 cây/ha (1,0x0,5 m); - CT2: 13.300 cây/ha (1,5x0,5 m); - CT3: 10.000 cây/ha (1,0x1,0 m); - CT4: 5.000 cây/ha (2,0x1,0 m). Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của phân bón đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của mật Nhân Thí nghiệm được bố trí 5 công thức phân bón, bao gồm: - CT1: Bón lót 3,0kg phân chuồng + 0,1kg phân hữu cơ vi sinh; - CT2: Bón lót 3,0kg phân chuồng + 0,1kg phân hữu cơ vi sinh + 0,1kg NPK; - CT3: Bón lót 3,0kg phân chuồng + 0,2kg NPK; - CT4: Bón lót 3,0kg phân chuồng; - CT5: Không bón phân (đối chứng). Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật làm đất đến tỷ lệ sống và sinh trưởng cây Mật nhân Bố trí 3 công thức thí nghiệm về kích thước hố trồng như sau: - CT1: Kích thước hố 30 x 30 x 30 cm; - CT2: Kích thước hố 40 x 40 x 40 cm; - CT3: Kích thước hố 40 x 40 x 50 cm; Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi cây con đem trồng đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của Mật nhân Bố trí 4 công thức tuổi cây con Mật nhân đem trồng như sau: - CT1: Cây 6 tháng tuổi; - CT2: Cây 9 tháng tuổi; - CT3: Cây 12 tháng tuổi; - CT4: Cây 15 tháng tuổi. Cây giống được chuẩn bị trước đảm bảo đủ tháng tuổi theo từng công thức thí nghiệm, cây khỏe mạnh, sinh trưởng phát triển tốt, thân thẳng, tròn đều; không bị sâu bệnh hại. Cây giống ở các độ tuổi cây con đem trồng khác nhau được trồng ở cùng thời điểm và các biện pháp kĩ thuật được áp như nhau. Các chỉ tiêu theo dõi được áp dụng như nhau ở các thí nghiệm từ TN1 đến TN5, cụ thể: đường kính gốc, chiều cao cây, đường kính tán, tỷ lệ sống, tình trạng sinh trưởng (A - tốt: thân cây thẳng, đẹp, tròn đều; cây khỏe mạnh, sinh trưởng phát 42 triển tốt; tán lá xum xuê, rất cân đối; không có dấu hiệu bị sâu bệnh hại; B - trung bình: thân cây thẳng; tán lá cân đối; cây sinh trưởng phát triển khá, không có dấu hiệu bị sâu bệnh hại; C - xấu: thân cây hơi cong, không tròn đều; cây kém phát triển (ngọn chính cong, ngọn khô hoặc mất ngọn chính,v.v.), tình hình sâu bệnh hại. Định kỳ 3 tháng 1 lần theo dõi, đo đếm các chỉ tiêu của từng CTTN ở tất cả các lần lặp. 2.2.6. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật thu hoạch, sơ chế và bảo quản Mật nhân 2.2.6.1. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật thu hoạch Mật nhân Các thí nghiệm nghiên cứu kỹ thuật thu hoạch Mật nhân được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, với 3 lần lặp lại. Các yếu tố không thí nghiệm được áp dụng như nhau ở tất cả các thí nghiệm (từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 3), bao gồm: cây Mật nhân 4 năm tuổi được thu hoạch tại mô hình rừng trồng tại Trung tâm Lâm nghiệp Nhiệt đới. Rễ cây được sơ chế bằng cách rửa sạch trên vòi nước áp lực cao để loại bỏ toàn bộ đất, cát, cắt bỏ rễ tơ. Cân khối lượng rễ tươi và khô theo từng công thức thí nghiệm. Lấy mẫu phân tích hàm lượng dược chất theo từng CTTN cho từng thí nghiệm (Ký hiệu, độ tuổi, vị trí các mẫu Mật nhân thí nghiệm được mô tả chi tiết tại Mục II, Phụ lục I). Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi thu hoạch đến hàm lượng dược chất Mật nhân Thí nghiệm bố trí 4 công thức, 3 lần lặp như sau: - CT1: Thu hoạch cây 2 năm tuổi; - CT2: Thu hoạch cây 3 năm tuổi; - CT3: Thu hoạch cây 4 năm tuổi; - CT4: Thu hoạch cây trên 4 năm tuổi. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ thu hoạch đến hàm lượng dược chất Mật nhân Tiến hành thí nghiệm khai thác Mật nhân vào 4 thời vụ tương đương 4 công thức, 3 lần lặp sau: - CT1: Trước mùa mưa (tháng 3); 43 - CT2: Giữa mùa mưa (tháng 7); - CT3: Cuối mùa mưa (tháng 9); - CT4: Sau mùa mưa (tháng 11). Đối tượng khai thác: cây Mật nhân trồng 4 năm tuổi. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch đến hàm lượng dược chất Mật nhân Tiến hành thí nghiệm với 3 công thức thí nghiệm, 3 lần lặp sau: - CT1: Thời kỳ ra lá; - CT2: Thời kỳ ra hoa; - CT3: Thời kỳ quả chín. Tại mỗi thời kỳ thu hoạch thu thập 15 mẫu rễ Mật nhân (5 xuất xứ: vùng Nam Trung Bộ 3 xuất xứ [Bình Định, Khánh Khòa và Phú Yên] và vùng Tây Nguyên 2 xuất xứ [Gia Lai và Kon Tum], mỗi xuất xứ 03 mẫu). Rễ cây được sơ chế bằng cách rửa sạch trên vòi nước áp lực cao để loại bỏ toàn bộ đất, cát, cắt bỏ rễ tơ. Cân khối lượng rễ tươi và khô theo từng công thức thí nghiệm. 2.2.6.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật sơ chế và bảo quản Mật nhân Các thí nghiệm nghiên cứu kỹ thuật sơ chế và bảo quản Mật nhân được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, với 3 lần lặp lại. Các yếu tố không thí nghiệm được áp dụng như nhau ở cả 2 thí nghiệm (thí nghiệm 1 và 2), bao gồm: cây Mật nhân trồng 4 năm tuổi. Rễ cây được sơ chế bằng cách rửa sạch trên vòi nước áp lực cao để loại bỏ toàn bộ đất, cát. Cân khối lượng rễ tươi theo từng công thức thí nghiệm. Lấy mẫu rễ phân tích hàm lượng dược chất. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp làm khô đến chất lượng dược liệu Mật nhân Mẫu được cân trước khi đưa vào thử nghiệm các phương pháp làm khô theo các công thức sau: - Công thức 1: Phơi nguyên liệu trong điều kiện nắng thông thường tại địa phương cho đến khi đạt độ ẩm ổn định (10- 12%); - Công thức 2: Sấy nguyên liệu bằng máy sấy ở nhiệt độ 40 0C cho đến khi 44 đạt độ ẩm ổn định (10 - 12%); - Công thức 3: Sấy nguyên liệu bằng máy sấy ở nhiệt độ 70 0C cho đến khi đạt độ ẩm (10 - 12%). Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp sơ chế và bảo quản đến thời gian bảo quản và chất lượng dược liệu Mật nhân Thí nghiệm bố trí 2 nhân tố, 3 lần lặp. - Nhân tố 1: Phương pháp sơ chế + Nguyên liệu được thái phiến dày 3 - 5 mm, sấy khô đưa vào bảo quản. + Nguyên liệu được cắt thành khúc nhỏ (2 - 3 cm), sấy khô đưa vào bảo quản. - Nhân tố 2: Phương pháp bảo quản - Bảo quản ở điều kiện thông thường (cho vào bao tải, bảo quản ở nhiệt độ phòng). - Bảo quản trong túi nilon có hút chân không và hàn miệng, bảo quản ở nhiệt độ phòng Định kỳ 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, và 12 tháng tiến hành lấy mẫu kiểm tra tình trạng nấm mốc, mối mọt và định lượng thành phần các dược chất chính. Các mẫu phục vụ nghiên cứu thu hoạch, sơ chế bảo quản Mật nhân được gửi về Viện Dược liệu phân tích các hàm lượng dược liệu chính của Mật nhân: Eurycomanone và Eurycomanol. 2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được tổng hợp, phân tích theo các nội dung nghiên cứu trên cơ sở phần mền R (Nguyễn Văn Tuấn, 2014). Tính toán các đặc trưng thống kê như sau: * Các chỉ tiêu về lâm học N = Mật độ tầng cây cao n * 10.000 N = (2.1) (D1,3≥6 cm): 2.500 trong đó n là số cây trong ô tiêu chuẩn. G = Tổng tiết diện ngang lâm phần (m2/ha). 45 i n 2 G Di (2.2) i 1 40000 (G tính bằng m2, D tính bằng cm) 3 M= trữ lượng rừng (m /ha): M = Mo*4, trong đó Mo là trữ lượng ô tiêu chuẩn, được tính như sau: M Gi * Hi * f (2.3) Trong đó: H i là chiều cao cây i, f là hình số (trong đề tài này lấy chung là 0,48). - Tổ thành được tính theo chỉ số quan trọng của loài (IV: Important Value) Xác định tổ thành tầng cây cao theo công thức: % % N i Gi IVi% = (2.4) 2 Trong đó: IV% là chỉ số quan trọng của loài i; Ni% là tỷ lệ % số cây của loài i so với tổng số cây trong lâm phần; Gi% là tỷ lệ % tiết diện ngang của loài so với tổng tiết diện ngang của lâm phần. Theo Daniel M, những loài cây nào có IV% > 5% thì loài đó mới thực sự có ý nghĩa về mặt sinh thái trong lâm phần và được tham gia vào công thức tổ thành. Nếu IV% < 5% thì loài đó không được tham gia vào công thức tổ thành. - Tổ thành tính theo số cây (N): Công thức tổ thành theo số cây biểu thị theo tỷ lệ số cây, hệ số tổ thành của loài được tính như sau: ni Ki = *10 (2.5) N Trong đó: ni là số cây của loài i trong OTC N là tổng số cây có trong OTC nghiên cứu Để xây dựng công thức tổ thành theo số cây hoàn chỉnh, cần xác định một số tiêu chí sau: - Số cá thể của từng loài (ni); - Số loài được thống kê (m);