Luận án Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN TRUNG TIẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED) TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN TRUNG TIẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED) TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên HÀ NỘI - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Trung Tiến ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy mà luận án của tôi đã được hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Trân trọng cảm ơn Lãnh đạo, toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1, các bạn bè và đồng nghiệp đã luôn tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Trung Tiến iii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................................ iii Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. vi Danh mục bảng ............................................................................................................... vii Danh mục hình ............................................................................................................... viii Trích yếu luận án .............................................................................................................. x Thesis abstract ................................................................................................................. xii Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4 2.1. Giới thiệu chung ................................................................................................... 4 2.2. Lịch sử bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn ............................................................... 4 2.3. Tình hình dịch PED trên thế giới và Việt Nam .................................................... 5 2.3.1. Tình hình dịch PED trên thế giới .......................................................................... 5 2.3.2. Tình hình dịch PED ở Viêṭ Nam........................................................................... 6 2.4. Căn bệnh ............................................................................................................... 8 2.4.1. Phân loại và hình thái của PEDV.......................................................................... 8 2.4.2. Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh ..................................................................... 9 2.4.3. Đặc tính nuôi cấy của virus ................................................................................ 12 2.4.4. Sức đề kháng của virus gây bệnh PED .............................................................. 12 2.4.5. Dịch tễ học lâm sàng ........................................................................................... 13 2.5. Dịch tễ học phân tử ............................................................................................. 16 2.6. Triệu chứng và bệnh tích của lợn mắc PED ....................................................... 18 2.6.1. Triệu chứng lâm sàng.......................................................................................... 18 2.6.2. Bệnh tích ............................................................................................................. 19 iv 2.7. Các phương pháp chẩn đoán PEDV ................................................................... 20 2.7.1. Phát hiện virus .................................................................................................... 20 2.7.2. Chẩn đoán phân biệt ........................................................................................... 23 2.7.3. Phân lập virus ...................................................................................................... 24 2.8. Phòng và điều trị bệnh ........................................................................................ 25 Phần 3. Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu ...................................... 30 3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 30 3.2. Thời gian thực hiện đề tài ................................................................................... 30 3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 30 3.3.1. Nghiên cứu tình hình dịch PED tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam ................. 30 3.3.2. Phân tích đặc điểm về trình tự gen...................................................................... 30 3.3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV ............. 30 3.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 31 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 31 3.5.1. Phương pháp điều tra một số đặc điểm dịch tễ ................................................... 32 3.5.2. Phương pháp theo dõi lâm sàng .......................................................................... 32 3.5.3. Phương pháp mổ khám ....................................................................................... 32 3.5.4. Phương pháp lấy mẫu ......................................................................................... 32 3.5.5. Phương pháp tách ARN tổng số ......................................................................... 32 3.5.6. Phương pháp tổng hợp cDNA ............................................................................ 33 3.5.7. Phương pháp phát hiện PEDV ............................................................................ 34 3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen............................................................................. 34 3.5.9. Phương pháp xác định khoảng cách di truyền .................................................... 35 3.5.10. Phương pháp xây dựng cây phả hệ ..................................................................... 35 3.5.11. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử ........................................ 35 3.5.12. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 36 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 37 4.1. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc từ 2013-2015 ............................... 37 4.1.1. Kết quả thiết lập phản ứng RT-PCR phát hiện PEDV ........................................ 37 4.1.2. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015 .......................... 41 4.1.3. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại ............................... 42 4.1.4. Kết quả theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc PED ................................. 44 v 4.2. Kết quả phân tích đặc điểm về trình tự gen ........................................................ 48 4.2.1. Đặc điểm gen S của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam ............................. 48 4.2.2. Đặc điểm gen ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam ....................................... 61 4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm về dịch tễ học phân tử của PEDV ........................ 67 4.3.1. Đặc điểm về sự lưu hành của PEDV theo nhóm di truyền ................................. 67 4.3.2. Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam ..................................... 73 4.3.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV theo không gian và thời gian ............. 75 Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 85 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 85 5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 85 Danh mục công trình công bố có liên quan đến luận án ................................................. 87 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 87 Phụ lục .......................................................................................................................... 103 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ CPE Cytopathogenic effect cs. Cộng sự DMEM Dulbecco's Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethyl Sulfoxide E Envelope EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic acid ELISA Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization FBS Fetal Bovine Serum M Membrane MOI Multiplicity of Infection N Nucleocapsid ORF Open Reading Frame ORF3 Open Reading Frame 3 PBS Phosphate Buffer Saline PDCoV Porcine deltacoronavirus PED Porcine Epidemic Diarrhea PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction S Spike protein TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGE Transmissible Gastroenteritis TGEV Transmissible Gastroenteritis Virus TPB Tryptose Phosphate Broth vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1. Thông tin về mồi đặc hiệu được dùng trong nghiên cứu ....................................... 31 3.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .................................................................. 34 4.1. Tương đồng trình tự nucleotide và amino acid của 11 chủng PEDV với các chủng tham chiếu ................................................................................................... 39 4.2. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu thu thập từ 2013-2015 .................................. 41 4.3. Tình hình dịch PED ở lợn của một số tỉnh miền Bắc theo trang trại ..................... 43 4.4. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PED ................................ 44 4.5. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PED ....................................... 46 4.6. Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 1 ................................................... 75 4.7. Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 2 nhóm châu Á ............................ 80 viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1. Hạt virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc ........................................ 9 2.2. Mô hình cấu trúc và bộ gen PEDV ........................................................................ 10 2.3. Hiệu giá của PEDV tồn tại trên bề mặt vật liệu theo thời gian ............................. 13 2.4. Con đường truyền lây của PEDV .......................................................................... 17 2.5. Bệnh tích đại thể ở lợn sơ sinh mắc PED .............................................................. 19 2.6. So sánh độ nhạy của một số phương pháp phát hiện PEDV ................................. 22 4.1. Kết quả RT-PCR phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm .................................... 37 4.2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR nhân lên bởi cặp mồi P1/P2 ......................... 38 4.3. Triệu chứng của lợn con theo mẹ mắc PED .......................................................... 45 4.4. Bệnh tích đại thể của lợn con theo mẹ mắc PED .................................................. 47 4.5. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen S của 38 chủng PEDV .................................. 49 4.6. Phân loại các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen S ......................... 50 4.7. Khoảng cách di truyền của gen S giữa các chủng PEDV ...................................... 51 4.8. Đột biến thêm- xóa ở gen S của 38 chủng PEDV ................................................. 52 4.9. Tốc độ thay đổi nucleotide tại các vị trí codon của gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên ................................................................................................. 54 4.10. Trình tự amino acid ở vùng COE của 38 chủng PEDV ........................................ 56 4.11. Trình tự amino acid ở vùng S1D của 38 chủng PEDV ......................................... 58 4.12. Trình tự amino acid ở vùng S10 của 38 chủng PEDV ........................................... 60 4.13. Trình tự nucleotide gen ORF3 của 12 chủng PEDV ............................................. 62 4.14. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen ORF3 của 12 chủng PEDV .......................... 63 4.15. Phân loại chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen ORF3 ........................ 64 4.16. Khoảng cách di truyền của gen ORF3 giữa các chủng PEDV .............................. 65 4.17. Trình tự amino acid ORF3 protein của 12 chủng PEDV....................................... 66 4.18. Cây phả hệ của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S ...................................... 68 4.19. Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dẫn tới các chủng của Việt Nam dựa vào trình tự gen S ........................................................................... 69 4.20. Cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen ORF3 ............................................... 70 ix 4.21. Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dựa vào gen ORF3 của genogroup 1 của Việt Nam ................................................................................................................ 72 4.22. Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ và một phần gen S (n =43) ......................................................................................................... 73 4.23. Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ và một phần gen S (n =911) ....................................................................................................... 74 4.24. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa vào trình tự gen ORF3 ............................................................................................................... 76 4.25. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa vào trình tự gen S ...................................................................................................................... 77 4.26. Sự phát tán theo không gian của genogroup 2 dựa vào gen ORF3 ....................... 79 4.27. Sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV nhánh châu Á ..................... 81 4.28. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV genogroup 2 nhánh châu Á .................................................................................... 82 4.29. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV genogroup 2 nhánh Bắc Mỹ ................................................................................... 83 x TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Nguyễn Trung Tiến Tên Luận án: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Trong nghiên cứu này trước tiên làm rõ tình hình dịch PED ở 10 tỉnh miền Bắc, bao gồm vùng đồng bằng sông Hồng và vùng trung du- miền núi. Trên cơ sở xác định được sự lưu hành của PEDV, đặc điểm dịch tễ học được phân tích đa chiều, đi sâu tìm hiểu những biến đổi có liên quan đến đáp ứng miễn dịch trung hòa virus. Đặc biệt, phân tích mối liên hệ về gen được thực hiện trên cơ sở dữ liệu lớn nhằm làm rõ nhiều đặc điểm dịch tễ học phân tử chưa được đề cập trong nhiều nghiên cứu trước đây. Phương pháp nghiên cứu Có hai nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) phương pháp RT-PCR dùng trong phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm và giải trình tự gen virus. (ii) Phương pháp phân tích đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm dịch tễ học phân tử dựa vào các phần mềm như BioEdit, MEGA, MAFFT, BEAST, v.v... Kết quả chính và kết luận Có 5 nhóm kết quả nghiên cứu chính đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) Bằng phản ứng RT-PCR, đã xác định được dịch PED đã xuất hiện ở một không gian trải rộng ở 10/10 tỉnh miền Bắc với tỷ lệ trung bình là 41,98% và liên tục theo thời gian (trong các năm thu thập mẫu từ 2013-2015). Các trang trại ở vùng đồng bằng có tỷ lệ trang trại dương tính PEDV cao hơn rõ rệt so với các trang trại ở các tỉnh trung du- miền núi (68,42% so với 35,29%). (ii) Lợn mắc PED có triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh: phân tanh và có mùi gây đặc trưng (64%), phân có sữa không tiêu (38%); ruột non trong (60%) và có cục sữa không tiêu ở các đoạn ruột (20%). (iii) Tính đa dạng di truyền của gen S và gen ORF3 của 38 chủng PEDV của Việt Nam được phân tích đa chiều về tỷ lệ % tương đồng, phân loại theo nhóm di truyền và khoảng cách di truyền giữa các chủng virus. Qua đó đã xác định được PEDV lưu hành ở xi Việt Nam không có nguồn gốc từ các chủng virus vacxin và có tính đa dạng di truyền với mức tương đồng trình tự gen S là 63,7% - 87,9% và gen ORF3 là 93% - 99%. Các chủng virus mang đột biến thêm- xóa và đột biến điểm ở vùng quyết định kháng nguyên của gen S được dự đoán không dẫn tới dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa. (iv) Phân tích cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen S và gen ORF3 được thực hiện