Luận án Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoariaRoscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một sốhợp chất có hoạt tính sinh học của chúng

LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án. Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này. Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014 Tác giả Võ Châu Tuấn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả Võ Châu Tuấn MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ..............................................................1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................3 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN.................................................3 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................5 1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ...................................................................5 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật ...............................................5 1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật .....................................................6 1.1.2.1. Nuôi cấy callus..................................................................................6 1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào................................................................7 1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào ...............10 1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào ................12 1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn ............................................16 1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO...................................................................................19 1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật .........................................19 1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật ................................19 1.2.2.1. Nhóm terpene ..................................................................................20 1.2.2.2. Nhóm phenol ...................................................................................20 1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen............................................................20 1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật..............................................................................................................................21 1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước........................................................21 1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước ........................................................25 1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN..............................................................28 1.3.2. Thành phần hóa học.............................................................................28 1.3.3. Công dụng .............................................................................................30 1.3.3.1. Công dụng cổ truyền.......................................................................30 1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học ....................................................................30 1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen ................35 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.37 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.........................................................................37 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................37 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................38 2.3.1. Nuôi cấy callus ......................................................................................39 2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào...................................................................39 2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác .............................39 2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men..................................40 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào ........................................40 2.3.4. Định lượng tinh dầu .............................................................................41 2.3.5. Định lượng curcumin ...........................................................................41 2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước ................................42 2.3.7. Xác định sesquiterpene ........................................................................42 2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu ..................................43 2.3.9. Xử lý thống kê.......................................................................................43 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................................44 3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN ................................................................44 3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC..............47 3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy.........................................................47 3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ....................................................................49 3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST .................................................................51 3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA ..........................................................................51 3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D......................................................................52 3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA ...........................................................52 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon.............................................................54 3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose...................................................................54 3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose...................................................................56 3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN.....................59 3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào .........................................................59 3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy......................................................61 3.3.2.1. Cỡ mẫu ............................................................................................61 3.3.2.2. Tốc độ khuấy ...................................................................................62 3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí .........................................................63 3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN.........................................................65 3.4.1. Hàm lượng tinh dầu .............................................................................65 3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số ...................67 3.4.3. Hàm lượng curcumin ...........................................................................68 3.4.4. Xác định sesquiterpene ........................................................................73 3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ...77 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................80 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................................................................................................................................. 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................83 PHỤ LỤC BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-benzylaminopurine BA : 6-benzyladenine CIB : centrifugal impeller bioreator cs : cộng sự DMSO : dimethyl sulfoxide ĐC : đối chứng ĐHST : điều hòa sinh trưởng HPLC : high performance liquid chromatography (sắc ký hiệu năng cao áp) IAA : indoleacetic acid IBA : indolebutyric acid Kin : kinetin L : lít L-DOPA : L-3,4 -dihydrooxyphenylamine LPS : lipopolysaccharide MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : naphthaleneacetic acid Nxb : nhà xuất bản TNF-α : tumor necrosis factor-alpha 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 44 2 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus 46 3 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 48 4 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 50 5 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 51 6 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 52 7 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 53 8 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 54 9 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 56 10 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 57 11 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 62 12 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 63 13 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 64 14 Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 66 15 Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 67 16 Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 69 17 Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự nhiên 74 18 Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen 78 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 1 Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro 37 2 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm 38 3 Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro (A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước 45 4 Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy 47 5 Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose 55 6 Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút 58 7 Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml đặt trên máy lắc 59 8 Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L 60 9 Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu 100 g 60 10 Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 61 11 Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu 200 g 65 12 Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml) 71 13 Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên 72 14 Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến 18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít 73 15 Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2 đến 18 ngày 76 16 Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen 77 1 MỞ ĐẦU  1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây (thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177]. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi của con người. Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [188]. Điều này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm [106]. 2 Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng [132]. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết ở quy mô công nghiệp các hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thể tạo ra các hợp chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổi các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài tự nhiên [140], [167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi Panax… [163]. Nghệ đen còn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó còn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82]. Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u; một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức 3 chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng chống viêm nhiễm [152]; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176]. Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào [75], [105], [169]. Trong tự nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29]. Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng” 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu 4 ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên men 10 L. - Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcumin, sesqu