Luận án Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh khác từ cá nóc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU ===o0o=== PHÙNG MINH DŨNG NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN LẬP TETRODOTOXIN VÀ MỘT SỐ ĐỘC TỐ THẦN KINH KHÁC TỪ CÁ NÓC LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU ===o0o=== PHÙNG MINH DŨNG NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN LẬP TETRODOTOXIN VÀ MỘT SỐ ĐỘC TỐ THẦN KINH KHÁC TỪ CÁ NÓC LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : Dược học cổ truyền MÃ SỐ : 62720406 Người hướng dẫn khoa học : PGS. TS. Trần Việt Hùng PGS. TS. Nguyễn Tiến Vững HÀ NỘI, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Trần Việt Hùng và PGS. TS. Nguyễn Tiến Vững. Các số liệu và kết quả được trình bày trong Luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Người cam đoan Phùng Minh Dũng LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các tập thể, thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trước hết, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: PGS. TS. Trần Việt Hùng, PGS. TS. Nguyễn Tiến Vững những người thày đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý Khoa học và Đào tạo – Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: PGS. TS. Nguyễn Tiến Đạt - Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam TS. Trần Minh Ngọc – Phó Viện trưởng, Viện Dược liệu ThS. Dương Minh Tân – Khoa Nghiên cứu phát triển, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương TS. Nguyễn Hoài Nam – Phó Viện trưởng, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam PGS. TS. Đỗ Thị Hà – Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu TS. Trịnh Thị Điệp – Khoa Hóa học, Trường Đại học Đà Lạt đã tạo mọi điều kiện phối hợp, giúp đỡ và đóng góp ý kiến quý báu cho tôi hoàn thiện luận án này. Cuối cùng, tôi xin cám ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên tôi, động viên, khích lệ tôi giúp tôi học tập, làm việc và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! NCS. Phùng Minh Dũng MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................ 0 LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... 0 MỤC LỤC ........................................................................................................................... 0 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ....................................................... 0 DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................. 0 DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................................... 0 MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ............................................................................................... 3 1.1. CÁ NÓC ..................................................................................................................... 3 1.1.1. Phân loại .............................................................................................................. 3 1.1.2. Phân bố ................................................................................................................ 3 1.1.3. Đặc điểm nhận dạng ............................................................................................ 2 1.2. TETRODOTOXIN ...................................................................................................... 4 1.2.1. Cấu trúc tetrodotoxin và các độc tố tương tự tetrodotoxin .................................. 4 1.2.2. Phân bố và nguồn gốc của tetrodotoxin trong tự nhiên ....................................... 7 1.2.3. Hàm lượng của tetrodotoxin và các dẫn chất trong cá nóc ............................... 13 1.2.4. Độc tính của tetrodotoxin và các dẫn chất ........................................................ 15 1.2.5. Tác dụng sinh học và cơ chế ............................................................................. 17 1.2.6. Khả năng ứng dụng của tetrodotoxin trong y học ............................................. 20 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ TETRODOTOXIN ................................... 27 1.3.1. Một số phương pháp chiết xuất, phân lập tetrodotoxin từ tự nhiên .................. 27 1.3.2. Một số phương pháp điều chế khác ................................................................... 30 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG TETRODOTOXIN VÀ DẪN CHẤT ..................................................................................................................... 33 1.4.1. Phương pháp sinh hóa ....................................................................................... 33 1.4.2. Phương pháp quang phổ .................................................................................... 34 1.4.3. Phương pháp sắc ký ........................................................................................... 35 1.4.4. Phương pháp phổ khối ....................................................................................... 38 1.4.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ................................................................. 41 1.5. CHẤT CHUẨN VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ................................................ 43 1.5.1. Chất chuẩn đối chiếu hóa học ............................................................................ 43 1.5.2. Phương pháp thiết lập chất chuẩn ...................................................................... 43 1.5.3. Đánh giá liên phòng thí nghiệm ........................................................................ 43 1.5.4. Chất chuẩn tetrodotoxin .................................................................................... 44 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................................... 46 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................. 46 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ............................................................................. 46 2.2.1. Hóa chất thuốc thử ............................................................................................. 46 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................ 46 2.2.3. Đôṇg vâṭ thí nghiêṃ .......................................................................................... 48 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 49 2.3.1. Thu mẫu, định danh, xử lý mẫu, bảo quản, vận chuyển cá nóc từ nơi thu mẫu đến phòng thí nghiệm .................................................................................................. 49 2.3.2. Nghiên cứu phát hiện, định tính, định lượng tetrodotoxin ................................ 51 2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học, phân lập tetrodotoxin và dẫn chất từ một số loài cá nóc .................................................................................................................... 55 2.3.4. Chiết xuất và tinh chế tetrodotoxin làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn ........ 56 2.3.5. Thiết lập chất chuẩn tetrodotoxin ...................................................................... 57 2.3.6. Bào chế và tiêu chuẩn hóa bột đông khô tetrodotoxin 0,1 % ............................ 59 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 63 3.1. XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU VỀ NGUỒN CÁ NÓC TETRADONTIDAE CÓ CHỨA TETRODOTOXIN ............................................................................................... 63 3.2. NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH Ở MỘT SỐ LOÀI CÁ NÓC (TETRAODONTIDAE) .................................................................................................... 64 3.2.1. Xác định nhanh độc tố của phủ tạng một số loài cá nóc ................................... 64 3.2.2. Xử lý mẫu, làm sạch qua cột chiết pha rắn ........................................................ 64 3.2.3. Định tính tetrodotoxin bằng sắc ký lớp mỏng ................................................... 67 3.2.4. Nghiên cứu phát hiện tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh khác từ một số loài cá nóc bằng các phương pháp hiện đại ................................................................. 69 3.2.5. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS) ....................................................................................................... 72 3.2.6. Khảo sát hàm lượng tetrodotoxin trong một số bộ phận của một số loài cá nóc ..................................................................................................................................... 75 3.3. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, PHÂN LẬP TETRODOTOXIN VÀ CÁC DẪN CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI CÁ NÓC .......................................................... 80 3.3.1. Phát hiện tetrodotoxin và nhóm chất tương tự tetrodotoxin (TTXs) từ một số loài cá nóc độc ............................................................................................................. 80 3.3.2. Xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin và một số độc tố thần kinh từ một số loài cá nóc .................................................................................................................... 84 3.3.3. Phân tích xác định cấu trúc các độc tố phân lập được từ 5 loài cá nóc ............. 84 3.4. NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TETRODOTOXIN Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ...... 92 3.4.1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tetrodotoxin thô ............................................. 92 3.4.2. Tinh chế tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng điều chế .............................................. 95 3.5. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA NGUYÊN LIỆU TETRODOTOXIN .. 98 3.6. NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TETRODOTOXIN .......................... 98 3.6.1. Nghiên cứu độ ổn định của tetrodotoxin trong một số dung môi ...................... 98 3.6.2. Nghiên cứu quy trình đóng ống chuẩn, 100 µg chất/lọ 1 ml, sử dụng dung môi thích hợp ...................................................................................................................... 99 3.6.3. Kiểm tra đánh giá chất lượng ống chuẩn ......................................................... 100 3.7. BÀO CHẾ BỘT ĐÔNG KHÔ TETRODOTOXIN 0,1 % ...................................... 102 3.7.1. Bào chế bột đông khô ...................................................................................... 102 3.7.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm nghiệm sản phẩm ................................... 103 3.7.3. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của bột đông khô 0,1% ................. 103 CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN ....................................................................................... 114 4.1. VỀ CƠ SỞ DỮ LIỆU NGUỒN CÁ NÓC VÀ ĐỘC TỐ CÁ NÓC ...................... 114 4.2. VỀ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TÍNH, ĐỘC TỐ THẦN KINH TETRODOTOXIN VÀ CÁC CHẤT TƯƠNG TỰ TETRODOTOXIN ................................................................................... 115 4.2.1. Sàng lọc, phát hiện độc tính bằng phương pháp sinh hóa chuột ..................... 115 4.2.2. Các phương pháp định tính tetrodotoxin và dẫn chất ..................................... 115 4.2.3. Các phương pháp định lượng tetrodotoxin ...................................................... 116 4.3. PHÂN LẬP TETRODOTOXIN VÀ NHÓM CHẤT TƯƠNG TỰ TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ LOÀI CÁ NÓC THU ĐƯỢC TỪ VÙNG BIỂN VIỆT NAM ............... 117 4.4. VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TETRODOTOXIN ĐẠT ĐỘ TINH KHIẾT LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN .......................... 119 4.4.1. Chiết xuất ......................................................................................................... 119 4.4.2. Tinh chế ........................................................................................................... 121 4.5. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TETRODOTOXIN .................................................. 122 4.6. BỘT ĐÔNG KHÔ TETRODOTOXIN 0,1 % ........................................................ 122 4.7. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ...................................................................... 123 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................................ 125 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 125 ĐỀ XUẤT ..................................................................................................................... 126 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................................... 127 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ATCC : Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Mỹ (American Type Culture Collection) CI : Kỹ thuật ion hoá hoá học (Chemical ionization) COSY : Correlation Spectroscopy cs. : Cộng sự DEPT : Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer ĐVTN : Động vật thử nghiệm EI : Kỹ thuật ion hoá điện tử (Electron Ionization) ELISA : Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ESI : Kỹ thuật ion hoá phun sương điện tử (Electric spray ionic) ED50 Liều của chất phơi nhiễm, trong cùng một thời điểm, gây ra ảnh hưởng sinh học khác nhau cho 50% (một nửa) của một nhóm động vật thử nghiệm (Effective Dose 50) FAB : Kỹ thuật bắn phá nguyên tử nhanh (Fast Atom Bombardment) FLD : Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector) FT ICR : Phổ cộng hưởng từ gia tốc ion chuyển dạng Fourier (Fourier transform ion cyclotron resonance) GC-MS : Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography - Mass spectrum) HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence LC MS : Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass spectrum) LC MS/MS : Sắc ký lỏng khối phổ ghép nối khối phổ (Liquid Chromatography tandem Mass spectrum) LD100 : Liều tối thiểu của chất phơi nhiễm, trong cùng một thời điểm, gây ra cái chết cho toàn bộ một nhóm động vật thử nghiệm (Lethal Dose 100) LD50 : Liều của chất phơi nhiễm, trong cùng một thời điểm, gây ra cái chết cho 50% (một nửa) của một nhóm động vật thử nghiệm (Lethal Dose 50) LOD : Giới hạn phát hiện (Limited of detection) LOQ : Giới hạn định lượng (Limited of quantification) MLD : Liều nhỏ nhất gây ra cái chết cá biệt ở động vật thí nghiệm khi thí nghiệm một nhóm động vật (minimum lethal dose) MU : Đơn vị chuột (mouse unit) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) NOESY : Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy PSP : Paralytic Shellfish Poisoning (độc tố gây liệt cơ do động vật nhuyễn thể) ROESY : Rotating frame Overhauser Effect Spectroscopy SPE : Chiết pha rắn (solid phase extraction) SRM : Chế độ kiểm soát chuỗi phản ứng (Selected reaction monitoring) STX : Saxitoxin TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TTX : Tetrodotoxin TTXs : Tetrodotoxin và các dẫn chất (Tetrodotoxin analogues) UV : Tử ngoại (Ultra violet) VGSC : Điện thế màng kênh Na (Voltage-Gated Sodium Channel) VKNTTW : Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Hàm lượng TTXs trong một số loài động vật biển khu vực Nhật Bản và Australia [82] ............................................................................................................... 10 Bảng 1. 2. Các loài vi khuẩn có khả năng sản sinh tetrodotoxin [150] .............................. 12 Bảng 1. 3. Sự thay đổi của độc tố ở buồng trứng của cá nóc hổ theo tháng [2] ................. 14 Bảng 1. 4. Phân bố TTXs trong một số bộ phận cá nóc F. Niphobles [68] ....................... 14 Bảng 1. 5. Hàm lượng TTXs trong 2 loài cá nóc T. nigroviridis và T. Biocellatu [68] ..... 14 Bảng 1. 6. Tình hình ngộ độc do cá nóc ở Việt Nam từ năm 1999 – 2003 [3] .................. 17 Bảng 1. 7. Hoạt tính của TTX trong thử tác dụng giảm đau ở sinh vật [118] .................... 22 Bảng 1. 8. Tác dụng của TTX trên thời gian sống trung bình ............................................ 25 Bảng 1. 9. Một số hãng cung cấp chuẩn TTX .................................................................... 44 Bảng 2. 1. Bảng chia mức độ độc của cá nóc theo phương pháp sinh hoá chuột [124] ..... 51 Bảng 2. 2. Cách pha dãy các dung dịch chuẩn ................................................................... 52 Bảng 3. 1. Mức độ độc của phủ tạng một số loài cá nóc .................................................... 64 Bảng 3. 2. Khảo sát độ thu hồi của TTX qua cột chiết SCX .............................................. 67 Bảng 3. 3. Khảo sát một số điều kiện sắc ký ...................................................................... 72 Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống ............................................................ 73 Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp ............................................. 73 Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát độ lặp lại ................................................................................ 74 Bảng 3. 7. Kết quả khảo sát độ thu hồi ............................................................................... 75 Bảng 3. 8. Kết quả định lượng TTX trong gan cá nóc chuột vân bụng .............................. 77 Bảng 3. 9. Kết quả định lượng TTX trong trứng cá nóc chuột vân bụng ........................... 77 Bảng 3. 10. Kết quả định lượng TTX trong gan cá nóc tro ................................................ 78 Bảng 3. 11. Kết quả định lượng TTX trong trứng cá nóc tro ............................................. 78 Bảng 3. 12. Kết quả định lượng TTX trong gan cá nóc vằn............................................... 79 Bảng 3. 13. Kết quả định lượng TTX trong trứng cá nóc vằn ............................................ 79 Bảng 3. 14. Hàm lượng TTX trong gan, trứng của một số loài cá nóc .............................. 80 Bảng 3. 15. Ký hiệu của các phân đoạn chất phân lập ra từ 05 loài cá nóc độc ................. 84 Bảng 3. 16. Dữ liệu phổ của TTX và 5 chất phân lập được ............................................... 85 Bảng 3. 17. Các chất độc tetrodotoxin và tương tự tetrodotoxin ....................................... 91 Bảng 3. 18. Lượng TTX thu được và độ tinh khiết đạt được ............................................. 94 Bảng 3. 19. Kết quả định lượng TTX trong mẫu sau khi tinh chế ..................................... 98 Bảng 3. 20. Tóm tắt chỉ tiêu chất lượng trong TCCS nguyên liệu TTX ............................ 98 Bảng 3. 21. Hàm lượng TTX trong một số dung môi theo thời gian ................................. 99 Bảng 3. 22. Kết quá đánh giá đồng nhất lô ...................................................................... 100 Bảng 3. 23. Các thông số của hệ sắc ký ...........................................................................