Luận án Nghiên cứu quá trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) phục vụ công tác nhân giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------------------------------------------- BÙI VĂN THẾ VINH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP TP. Hồ Chí Minh - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------------------------------------------- BÙI VĂN THẾ VINH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62.62.01.11 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Dƣơng Tấn Nhựt 2. TS. Đỗ Khắc Thịnh TP. Hồ Chí Minh - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự chỉ bảo của các thầy hƣớng dẫn và sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng – Viện nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 9 năm 2015 Nghiên cứu sinh Bùi Văn Thế Vinh ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc luận án này, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, quan tâm và tận tình giúp đỡ của rất nhiều thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và ngƣời thân. Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt và TS. Đỗ Khắc Thịnh đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Quý thầy cô, các anh chị đang công tác tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tận tình hƣớng dẫn, truyền dạy cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập cũng nhƣ đóng góp cho tôi những ý kiến bổ ích để tôi có những định hƣớng cụ thể trong quá trình thực hiện nghiên cứu và sinh hoạt chuyên môn tại cơ sở đào tạo. Các anh chị, các bạn tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống Cây trồng – Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên và Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới; các thầy cô, đồng nghiệp tại Trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận án. Các anh chị nghiên cứu sinh: Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Văn Lợt, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Phúc Huy, Trần Trọng Tuấn; các bạn: Thái Thƣơng Hiền, Vũ Thị Thủy, Hoàng Thanh Tùng, Hoàng Xuân Chiến, Trịnh Thị Hƣơng, Lê Kim Cƣơng, Hồ Thanh Tâm, Đỗ Mạnh Cƣờng, Nguyễn Việt Cƣờng, Hoàng Văn Cƣơng, Trần Xuân Tình,... đã cùng tôi học tập, nghiên cứu, chia sẻ và động viên nhau trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu, thực hiện luận án. Cuối cùng, xin gởi lòng biết ơn chân thành đến những ngƣời thân yêu trong gia đình, các đồng nghiệp và bạn bè gần xa đã luôn quan tâm giúp đỡ, động viên tinh thần cho tôi trong suốt những năm vừa qua. TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 9 năm 2015 Bùi Văn Thế Vinh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... x DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................... xii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ xiii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1 2. Mục tiêu, yêu cầu của đề tài ................................................................................. 2 3. Những đóng góp mới của luận án......................................................................... 3 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................. 3 5. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................ 4 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC ....................... 6 1.1. Giới thiệu về chi sâm ........................................................................................... 6 1.2. Giới thiệu về cây sâm Ngọc Linh .......................................................................... 8 1.2.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển ....................................................................... 8 1.2.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 9 1.2.3. Phân bố .......................................................................................................... 10 1.2.4. Tác dụng dược lý của cây sâm Ngọc Linh ..................................................... 11 1.2.4.1. Kết quả nghiên cứu về dƣợc lý thực nghiệm của sâm Ngọc Linh .............. 11 1.2.4.2. Kết quả nghiên cứu về dƣợc lý lâm sàng của sâm Ngọc Linh .................... 14 1.2.5. Tình hình nghiên cứu sâm Ngọc Linh ............................................................ 15 1.2.5.1. Nghiên cứu phát sinh loài sâm Ngọc Linh .................................................. 15 1.2.5.2. Nghiên cứu nhân giống từ hạt ..................................................................... 16 1.2.5.3. Nghiên cứu tạo rễ bất định .......................................................................... 17 1.2.5.4. Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro ...................................................... 19 1.2.5.5. Nghiên cứu tạo củ in vitro ........................................................................... 20 iv 1.2.5.6. Nghiên cứu phát sinh hình thái ................................................................... 20 1.2.5.7. Nghiên cứu hàm lƣợng saponin và dƣ lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong mẫu nuôi cấy in vitro ......................................................................... 21 1.3. Giới thiệu về phôi vô tính .................................................................................. 21 1.3.1. Quá trình phát sinh phôi ở thực vật ............................................................... 22 1.3.2. Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng ......................... 24 1.3.3. Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính ................................................................. 28 1.3.4. Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính ........................................... 29 1.3.5. Sự phát sinh phôi vô tính ................................................................................ 31 1.3.6. Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính ....................................................... 32 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh phôi vô tính........................... 35 1.4.1. Chất điều hòa sinh trưởng.............................................................................. 35 1.4.2. Nguồn nitơ ...................................................................................................... 37 1.4.3. Đường ............................................................................................................. 38 1.4.4. pH ................................................................................................................... 38 1.4.5. Ánh sáng ......................................................................................................... 39 1.4.6. Polyamine ....................................................................................................... 39 1.5. Các kỹ thuật chỉ thị DNA .................................................................................. 43 1.6. Kỹ thuật đa hình DNA nhân ngẫu nhiên (RAPD) ........................................... 46 1.6.1. Nguyên lý RAPD ............................................................................................. 47 1.6.2. Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD ............................................................... 47 1.6.3. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật RAPD .............................................................. 48 1.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD ........................................................................ 49 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài nghiên cứu ......................................... 50 2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 50 2.2.1. Vật liệu ........................................................................................................... 50 2.2.2. Hóa chất ......................................................................................................... 51 2.2.3. Thiết bị ............................................................................................................ 51 2.2.4. Môi trường nuôi cấy ....................................................................................... 51 v 2.2.5. Điều kiện nuôi cấy .......................................................................................... 52 2.3. Nội dung nghiên cứu và phương pháp bố trí thí nghiệm ................................ 52 2.3.1. Cảm ứng tạo mô sẹo có tiềm năng phát sinh phôi ......................................... 52 2.3.1.1. Đánh giá ảnh hƣởng của nguồn vật liệu mẫu cấy lên khả năng cảm ứng tạo mô sẹo có tiềm năng phát sinh phôi sâm Ngọc Linh .......................................... 52 2.3.1.2. Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng khoáng cơ bản lên khả năng tạo mô sẹo có tiềm năng phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh .................................... 54 2.3.2. Cảm ứng tạo phôi vô tính từ mô sẹo có tiềm năng phát sinh phôi ................. 55 2.3.2.1. Đánh giá ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ........................................................... 55 2.3.2.2. Đánh giá ảnh hƣởng của nguồn carbohydrate lên khả năng cảm ứng phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ..................................................... 56 2.3.3. Gia tăng tỉ lệ phát sinh phôi và số lượng phôi vô tính sâm Ngọc Linh ................ 57 2.3.3.1. Đánh giá ảnh hƣởng của một số acid amine lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh .................................................................................. 57 2.3.3.2. Đánh giá ảnh hƣởng của một số polyamine lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh ........................................................................... 58 2.3.3.3. Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng nuôi cấy lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ........................................................... 59 2.3.3.4. Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh .................................................................................. 60 2.3.4. Đánh giá sơ bộ mức độ đồng nhất di truyền của cây con sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ phôi vô tính ..................................................................................... 60 2.3.4.1. Tách chiết DNA .......................................................................................... 60 2.3.4.2. Phân tích chỉ thị RAPD ............................................................................... 61 2.3.5. Đánh giá khả năng sống sót, sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro ................................................................................................ 62 2.3.5.1. Đánh giá ảnh hƣởng của giá thể lên khả năng sống sót, sinh trƣởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro trong điều kiện nhân tạo ......... 62 2.3.5.2. Đánh giá ảnh hƣởng của giá thể lên khả năng sống sót, sinh trƣởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro trong điều kiện sinh thái tự nhiên ..................................................................................................................... 63 vi 2.4. Nghiên cứu hình thái giải phẫu và cấu trúc phôi ............................................ 63 2.4.1. Quan sát hình thái giải phẫu bằng kính hiển vi huỳnh quang ....................... 63 2.4.2. Quan sát cấu trúc phôi bằng kính hiển vi điện tử quét .................................. 64 2.5. Phân tích và xử lý số liệu .................................................................................. 64 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 66 3.1. Ảnh hưởng của nguồn vật liệu mẫu cấy lên khả năng tạo mô sẹo có tiềm năng phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh ........................................................... 66 3.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng cơ bản lên khả năng tạo mô sẹo có tiềm năng phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh................................................... 68 3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên khả năng phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh ............................................................................ 71 3.4. Ảnh hưởng của nguồn carbohydrate lên khả năng cảm ứng phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh .................................................................... 77 3.4.1. Ảnh hưởng của đường sucrose lên sự phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ........................................................................................................... 77 3.4.2. Ảnh hưởng của đường glucose lên sự phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ........................................................................................................... 81 3.4.3. Ảnh hưởng của đường fructose lên sự phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ........................................................................................................... 83 3.4.4. So sánh hiệu quả của 3 loại đường ................................................................ 85 3.5. Ảnh hưởng của một số acid amine lên sự phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ................................................................................................... 87 3.5.1. Ảnh hưởng của arginine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh .................................................................................................................. 87 3.5.2. Ảnh hưởng của ornithine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh .................................................................................................................. 89 3.6. Ảnh hưởng của một số polyamine lên sự phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ................................................................................................... 91 3.6.1. Ảnh hưởng của putrescine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh .................................................................................................................. 91 3.6.2. Ảnh hưởng của spermidine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh .................................................................................................................. 95 vii 3.6.3. Ảnh hưởng của spermine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh .................................................................................................................. 97 3.6.4. Kết quả phân tích hàm lượng PA nội sinh ................................................... 100 3.7. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh .......................................................................... 104 3.8. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ........................................................................................... 106 3.9. Sự thay đổi hình thái và cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh ....................................................................................................... 109 3.10. Đánh giá sơ bộ mức độ đồng nhất di truyền của cây sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ phôi vô tính ....................................................................................... 114 3.11. Ảnh hưởng của một số giá thể lên sự sống sót, sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro ..................................................... 121 3.11.1.Tỉ lệ sống sót, sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh in vitro ở điều kiện nhân tạo ................................................................................................ 121 3.11.2.Tỉ lệ sống sót, sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh in vitro ở điều kiện sinh thái tự nhiên .................................................................................. 127 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 133 1. Kết luận .............................................................................................................. 133 2. Đề nghị ............................................................................................................... 134 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ........................................................... 135 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................. 136 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ABA Abscisic acid ADC Arginine decarboxylase AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Arg Arginine ATP Adenosine triphosphate BA Benzyladenine Cad Cadaverine cs. Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid EC Embryogenic callus GA Gibberellic acid HPLC High-performance liquid chromatography IAA Indole acetic acid IBA Indole butyric acid LED Light emitting diode LHC Light-harvesting complex MS Murashige and Skoog (1962) NAA Naphthalene acetic acid NO Nitric oxide ODC Ornithine decarboxylase Orn Ornithine PA Polyamine PCR Polymerase chain reaction PEM Proembryogenic mass Put Putrescine RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA RNA Ribonucleic acid SAM S-adenosyl-methionine ix SAMDC S-adenosyl-methionine decarboxylase SH Schenk and Hildebrandt (1972) Spd Spermidine Spm Spermine SSR Simple Sequence Repeat TBA - RS Thiobarbituric reactive subtance TDZ Thidiazuron TNF Tumor necrosis factor TPA 12-O-tetredecanoylphorbol-13 acetate VG Vina-ginsenoside UV Ultraviolet x DANH MỤC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Các loài thuộc chi Panax trên thế giới 6 1.2 Các kỹ thuật chỉ thị DNA 44 2.1 Thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của 2,4-D kết hợp với kinetin hoặc NAA lên khả năng cảm ứng phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 55 2.2 Thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của 2,4-D kết hợp với kinetin và NAA lên khả năng cảm ứng phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 56 2.3 Thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của carbohydrate lên khả năng cảm ứng phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 57 2.4 Thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của acid amine lên khả năng nâ