Luận án Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ VŨ THỊ HOAN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2018 BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ VŨ THỊ HOAN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 9540105 Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Trần Thị Luyến PGS. TS. Vũ Ngọc Bội KHÁNH HÒA - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu được thực hiện từ kinh phí của Đề tài Cấp Nhà nước KC07.02/11-15:“Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm oligosaccharid (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” do PGS. TS. Vũ Ngọc Bội chủ trì và đã được Chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng trong Luận án. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu nào trước đó. Tác giả luận án LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này, Trước hết, tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Lãnh đạo Khoa Sau đại học và Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm lòng biết ơn và niềm tự hào được học tập tại Trường trong những năm qua. Lòng biết ơn sâu sắc nhất xin được gửi tới GS. TS Trần Thị Luyến – nguyên Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Nha Trang và PGS. TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ, tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án này. Xin chân thành cám ơn PGS. TS. Vũ Ngọc Bội - Chủ nhiệm đề tài Cấp Nhà nước KC07.02/11-15: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm oligosaccharid (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” đã tạo điều kiện về kinh phí để Luận án hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đàm Sao Mai - Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh và các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Xin chân thành cám ơn PGS. TS. Trang Sĩ Trung - Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang, PGS. TS. Nguyễn Anh Tuấn, TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo - Bộ môn Công nghệ Chế biến, TS. Nguyễn Thị Mỹ Hương - Trưởng Bộ môn Công nghệ Sau thu hoạch - Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang, PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và các thầy cô phản biện đã cho tôi lời khuyên quý báu để Luận án hoàn thành có chất lượng. Xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo tại các phòng thí nghiệm - Trung tâm Thực hành Thí nghiệm và các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm -Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên, cùng tôi chia sẻ khó khăn trong suốt thời gian thực hiện Luận án này. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA: Phân tích phương sai (Analysis of variance) AOAC: Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống (Association of Official Analytical Chemists). BSA: Huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin) BHI: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật BHI (Brain Heart Infusion) COSY: Phổ tương quan giữa proton-proton (Correlation Spectroscopy) COS: Chitooligosaccharides CTS: Chitosan DA: Độ acetyl (Degree of Acetylation) DD: Độ deacetyl (Degree of Deacetylation) DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid GlcN: D-glucosamine GlcNAc: N-acetyl glucosamine GPC: Sắc ký gel thấm qua (Gel Permeation Chromatography) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HQKK: Hiệu quả khử khoáng HQKP: Hiệu quả khử protein HSQC: Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết (Heteronuclear Single Quantum Correlation) LMWC: Chitosan khối lượng phân tử thấp (Low Molecular Weight Chitosan) MHS: Phương trình Mark-Houwink-Sakurada MIC: Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration) MRS: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (de Man, Rogosa, Sharpe) Mw: Phân tử lượng trung bình khối lượng Mv: Phân tử lượng trung bình thể tích NAG: N- acetyl glucosamine NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) OD: Mật độ quang (Optical Density) Phổ IR: Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) TCA: Trichloroacetic acid TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam X-ray: Tia X MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... xii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................xvii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .......................................... xix MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 1.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN ..................... 3 1.1.1. Giới thiệu về chitin, chitosan và oligochitosan........................................................... 3 1.1.1.1. Chitin và chitosan .................................................................................................... 3 1.1.1.2. Oligochitosan ........................................................................................................... 5 1.1.2. Phương pháp sản xuất chitin và chitosan .................................................................... 6 1.1.3. Phương pháp sản xuất oligochitosan ........................................................................ 19 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG OLIGOCHITOSAN .............................................. 30 1.3. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ BIẾN ĐỔI VÀ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN TÔM SAU THU HOẠCH .......................................................................................................................................... 32 1.3.1. Cơ sở lý thuyết về biến đổi của tôm sau thu hoạch .................................................. 32 1.3.2. Phương pháp bảo quản tôm sau thu hoạch ............................................................... 34 1.4. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT BỨC XẠ ............................................................................... 37 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 39 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................................................ 39 2.1.1. Đầu vỏ tôm dùng sản xuất oligochitosan .................................................................. 39 2.1.2. Tôm bạc biển ............................................................................................................ 39 2.1.3. Enzyme protease ....................................................................................................... 39 2.1.4. Nguyên vật liệu để xác định độc chất học ................................................................ 39 2.1.5. Giống vi khuẩn ......................................................................................................... 40 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 40 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................................. 40 2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa học ......................................................................... 46 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease ...................................................... 48 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn ........................................................................... 48 2.2.4.1. Phương pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic ........................................................... 48 2.2.4.2. Phương pháp phân tích vi sinh vật ........................................................................ 49 2.2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan.................. 49 2.2.5. Phương pháp xác định độc chất học ......................................................................... 50 2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN ............ 51 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................................... 52 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 53 3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA PHẾ LIỆU ĐẦU VỎ TÔM ...... 53 3.2. NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ TẠP CHẤT Ở ĐẦU VỎ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TRONG SẢN XUẤT CHITIN .................... 53 3.2.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME PROTEASE ..................................................................................................... 53 3.2.1.1. Nghiên cứu lựa chọn enzyme protease .................................................................. 53 3.2.1.2. Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng NaOH loãng và khử khoáng bằng HCl loãng ................................................................................................................... 60 3.2.1.3. Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme khử protein ..................................................................................................... 63 3.2.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ CÁC TẠP CHẤT ................................ 65 3.2.2.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp ............................................................. 65 3.2.2.2. Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất ................................................ 70 3.2.2.3. Nghiên cứu khử protein còn lại ở bán chế phẩm chitin bằng enzyme flavourzyme ... 80 3.2.2.4. Nghiên cứu khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl ......................................... 82 3.2.2.5. Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất ...................................... 84 3.2.2.6. Đánh giá chất lượng chitin sản xuất theo quy trình sử vi khuẩn lactic để khử proteinvà các tạp chất ......................................................................................................... 86 3.3. NGHIÊN CỨU DEACETYL CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO ......................................................................................................... 88 3.3.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NAOH THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH DEACETYL CHITIN. 88 3.3.2. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN DEACETYL .............................................................................. 89 3.3.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO ............ 93 3.4. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM OLIGOCHITOSAN BẰNG KỸ THUẬT BỨC XẠ COBAN 60 .................................................................................................... 97 3.4.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ HÒA TAN CỦA CHITOSAN TRONG DUNG DỊCH ACID ............... 97 3.4.2. XÁC ĐỊNH LIỀU XẠ THÍCH HỢP CHO VIỆC CẮT MẠCH CHITOSAN TẠO OLIGOCHITOSAN ....................................................................................................................... 99 3.4.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITOSAN SAU KHI CHIẾU XẠ ................................ 102 3.4.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA CO-60 .................................................................. 103 3.4.5. NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA OLIGOCHITOSAN SẢN XUẤT BẰNG CÁCH SỬ DỤNG BỨC XẠ ĐỂ PHÂN CẮT CHITOSAN ................................................................................................................................. 105 3.4.5.1. Đánh giá thành phần các phân đoạn của chế phẩm chiếu xạ chitosan ................ 105 3.4.5.2. Sử dụng phổ FTIR để đánh giá cấu trúc của sản phẩm sau chiếu xạ chitosan ............. 106 3.4.5.3. Xác định khối lượng phân tử và cấu trúc của oligochitosan................................ 109 3.4.6. NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA OLIGOCHITOSAN 114 3.4.6.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp MIC... 114 3.4.6.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch ...................................................................................................... 115 3.4.7. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH HOÀN THIỆN SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA COBAN 60 ................................................. 116 3.4.8. THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA OLIGOCHITOSAN TRÊN CHUỘT LANG THÍ NGHIỆM ........................................................................................................................... 117 3.5. SỬ DỤNG OLIGOCHITOSAN TRONG BẢO QUẢN TÔM BẠC NGUYÊN LIỆU ..... 125 3.5.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ OLIGOCHITOSAN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN TÔM ................................................................................................................................ 125 3.5.2. XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU BẰNG OLIGOCHITOSAN 129 3.5.2.1. Xác định thời gian nhúng tôm nguyên liệu bằng dung dịch oligochitosan ......... 129 3.5.2.2. Xác định chế độ bao gói thích hợp để bảo quản tôm bạc bằng oligochitosan ..... 134 3.5.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BẢO QUẢN TÔM BẰNG OLIGOCHITOSAN .................... 140 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN.......................................................................... 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 145 xii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin và chitosan ........................................................ 4 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của oligochitosan ............................................................... 6 Hình 1.3. Phương trình phản ứng deacetyl chitin .......................................................... 13 Hình 1.4. Quy trình sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp hóa học................. 16 Hình 1.5. Sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp sinh học ............................... 17 Hình 1.6. Một số phương pháp tạo oligochitosan từ chitosan ....................................... 20 Hình 1.7. Quy trình sản xuất oligochitosan theo phương pháp hóa học ....................... 22 Hình 1.8. Sơ đồ thủy phân chitin và chitosan bằng enzyme ......................................... 23 Hình 1.9. Quá trình biến đổi của chitosan khi chiếu xạ ................................................ 26 Hình 1.10. Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl .......................................... 26 Hình 1.11. Sự suy giảm khối lượng phân tử của chitosan được chiếu xạ tia gamma Co- 60 theo liều xạ................................................................................................................ 27 Hình 1.12. Cơ chế hình thành biến đen của tôm ........................................................... 33 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ........................................................................... 41 Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khử protein và tạp chất ở đầu vỏ tôm bằng enzyme protease . 42 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm khử protein bằng lên men vi khuẩn lactic ......................... 43 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm so sánh khả năng khử protein ............................................ 43 Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm deacetyl chitin để thu nhận chitosan ................................. 44 Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp sử dụng bức xạ Co -60 ................................................................................................................ 45 Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm bảo quản tôm nguyên liệu ................................................. 45 Hình 2.8. Quy trình hoạt hóa vi khuẩn lactic ................................................................ 48 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme...................................................................................................... 63 Hình 3.2. Bán chế phẩm chitin sau khi khử protein bằng enzyme flavourzyme .......... 65 Hình 3.3. Sản phẩm chitin sản xuất bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme .... 65 Hình 3.4. Sự thay đổi độ đục của dịch nuôi cấy vi khuẩn theo thời gian ...................... 66 Hình 3.5. Dịch vi khuẩn L. plantarum sau 28 h nuôi cấy ............................................. 66 xiii Hình 3.6. Khuẩn lạc vi khuẩn L. plantarum mọc trên đĩa thạch ................................... 66 Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch sinh khối vi khuẩn đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm ..................................................................................................................... 67 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm ..... 68 Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm ......... 69 Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 bổ sung đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm ................................................................. 71 Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 ........................................................ 72 Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường tới hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 ............................................................. 73 Hình 3.13. Ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường bổ sung đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 ........................................................ 75 Hình 3.14. Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và tỷ lệ dịch vi khuẩn đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum ....................................... 78 Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và tỷ lệ dịch vi khuẩn đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum ........................................................................................... 78 Hình 3.16. Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên men đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum .......................................... 79 Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên men đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L. plantarum ........................................................................................... 79 Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme flavourzyme bổ sung đến hàm lượng protein còn lại ở chitin thô ......................................................................................................... 81 Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian khử protein bằng enzyme flavourzyme đến hàm lượng protein còn lại ở chitin thô .................................................................................. 82 Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hàm lượng khoáng còn lại ở chế phẩm chitin ...... 83 Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl ... 84 Hình 3.22. Quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng