Luận án Nghiên cứu sự khác biệt trình tự NucleoTide của các vùng Gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẶNG THANH LONG NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA CÁC VÙNG GENE CHỈ THỊ Ở CÁC MẪU SEN TRỒNG TẠI HUẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ HẠT SEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG - 2023 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẶNG THANH LONG NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA CÁC VÙNG GENE CHỈ THỊ Ở CÁC MẪU SEN TRỒNG TẠI HUẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ HẠT SEN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 94 20 201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. HOÀNG THỊ KIM HỒNG 2. TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM ĐÀ NẴNG - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Đà Nẵng, ngày 15 tháng 06 năm 2023 Tác giả luận án Đặng Thanh Long ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cô PGS.TS. Hoàng Thị Kim Hồng, TS. Lê Lý Thùy Trâm đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến Sở khoa học và Công nghệ tỉnh Thừa Thiên Huế và Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VINBIGDATA) đã hỗ trợ kinh phí cho tôi để thực hiện đề tài luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Ban Quản lý đào tạo, Khoa hóa, Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Đà Nẵng, ngày 15 tháng 06 năm 2023 Nghiên cứu sinh Đặng Thanh Long iii MỤC LỤC Số trang LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... vi DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. xi DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ ...................................................................... xii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 3 2.1. Mục tiêu chung .............................................................................................. 3 2.2. Mục tiêu cụ thể .............................................................................................. 3 3. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................. 4 4. Những đóng góp mới của đề tài .............................................................................. 4 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................ 5 5.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 5 5.2. Ý nghĩa thực tiển ........................................................................................... 5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 6 1.1. Giới thiệu về cây sen ............................................................................................ 6 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại .............................................................................. 6 1.1.2. Đặc điểm chung của cây sen ...................................................................... 6 1.1.3. Đặc điểm hệ gene cây sen .......................................................................... 8 1.2. Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA ở thực vật trên thế giới và Việt Nam ................ 14 1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới ........................................................................... 14 1.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................................ 23 1.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây sen trên thế giới và Việt Nam ..................... 25 1.3.1. Nghiên cứu trên thế giới ........................................................................... 25 1.3.2. Nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................................ 32 iv 1.4. Nghiên cứu hợp chất và hoạt tính sinh học từ cây sen ....................................... 34 1.4.1. Nghiên cứu phân lập và xác định các hợp chất từ cây sen ....................... 34 1.4.2. Nghiên cứu hoạt tính của dịch chiết và cao chiết từ cây sen .................... 38 1.4.3. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của hợp chất tinh khiết từ cây sen ........... 43 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................50 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 50 2.1.1. Nguyên liệu cây sen .................................................................................. 50 2.1.2. Nguồn vật liệu sử dụng trong các thí nghiệm sinh học phân tử ............... 54 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 55 2.2.1. Phương pháp thu mẫu ............................................................................... 55 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử ................................................................. 56 2.2.3. Phương pháp phân lập hợp chất và thử nghiệm hoạt tính sinh học .......... 60 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 67 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 68 3.1. Kết quả khuếch đại PCR và phân tích trình tự nucleotide một số vùng gene chỉ thị............ .................................................................................................................. 68 3.2. Kết quả phân tích đặc tính di truyền một số mẫu sen trồng tại Huế dựa trên 10 vùng gene chỉ thị ....................................................................................................... 70 3.2.1. Kết quả phân tích đặc tính phân tử 10 vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế .................................................................................... 70 3.2.2. Kết quả phân tích đặc tính di truyền 10 vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế .................................................................................... 71 3.3. Kết quả phân tích đặc tính di truyền giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng dựa trên tổ hợp 9 vùng gene chỉ thị lục lạp ............................................................... 86 3.4. Phân tích quá trình tiến hóa của một số mẫu sen trồng tại Huế dựa trên 10 vùng gene chỉ thị ................................................................................................................. 88 3.4.1. Chỉ thị vùng gene nhân ............................................................................. 88 3.4.2. Chỉ thị vùng gene lục lạp .......................................................................... 90 3.5. Kết quả khảo sát dung môi chiết cao tổng số từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ......... 95 v 3.6. Kết quả định tính và định lượng alkaloid và flavonoid trong một số cao chiết thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ......................................................................... 96 3.7. Kết quả phân lập hợp chất tinh khiết ở phân đoạn n-B thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ......................................................................................................... 98 3.8. Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học ............................................................ 103 3.8.1. Hoạt tính kháng oxy hóa ......................................................................... 103 3.8.2. Hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư................................ 106 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 114 4.1. Kết luận ............................................................................................................ 114 4.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 115 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 117 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 139 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACN : Acetonitril AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài nhân bản chọn lọc) AS-PCR : Allele specific polymerase chain reaction (Nhân bản allen đặc biệt) ASO : Allele specific oligo (Các oligo allen đặc biệt) AP-PCR : Arbitrarily primed PCR (Tạo ra do phản ứng PCR với các mồi tùy tiện) ACN : Acetonitril BLAST : Basic Local Alignment Search Tool (Công cụ tìm kiếm đối chiếu cơ bản) CBOL : Consortium for the Barcode of Life (Hiệp hội Mã vạch sự sống) CCC : Counter-current chromatography (Sắc ký ngược dòng hay đối lưu) COI : Cytochrome c oxidase subunit I DNA : Deoxyribonucleic acid DPPH : 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl EtOAc : Ethyl acetat EtOH : Ethanol ESI-MS : Electron Spray Ionisation - Mass Spectrometry (Khối phổ - ion hóa phun mù electron) GC : Gas Chromatography (Sắc ký khí) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HPLC-MS : High Performance Liquid Chromatography– Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng - khối phổ) HSV-1 : Virus herpes simplex virus-1 IC50 : Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ gây ức chế 50% hoạt tính sinh học hoặc hóa sinh) vii LPS : Lipopolysaccharides ITS : Internal transcribed spacers mRNA : Messenger RNA (RNA thông tin) mg : miligam mL : Mililit n-Bu : n-Buthanol NCBI : GenBank database (Ngân hàng gene Mỹ) NGS-Next : Next-generation sequencing (Giải trình tự thế hệ thứ hai) OD : Optical Density (Mật độ quang học) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RFLP : Restriction fragment length polymorphism (Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế) RAPD : Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên) rRNA : Ribosome rRNA RE : Restriction enzyme (Enzyme cắt hạn chế) SSR : Simple Sequence Repeats (Các chuỗi lặp lại đơn giản) SCAR : Sequence Characterised Amplification Regions (Vùng nhân bản chuỗi được mô tả) SCoT Start Codon Targeted (Vị trí codon mã hoá) SSCP : Single stranded conformation polymorphism (Đa hình cấu tạo sợi đơn) STS : Sequence tagged site (Vị trí chuỗi đánh dấu) STMS : Sequence tagged microsatellite site (Vị trí trình tự tiểu vệ tinh được đánh dấu) TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng) tRNA : Transfer RNAs (RNA vận chuyển) UHPLC : Ultra-High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu hiệu năng) viii UV-VIS : Ultraviolet - Visible (Tử ngoại - khả kiến) UV : Ultraviolet (Tử ngoại) VNTR : Variable number tandem repeat (Số lượng thay đổi các chuỗi lặp lại liền kề) µg : microgram μL : microlit ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. So sánh các bộ gene giữa các giống sen được lắp ráp dựa trên các công nghệ giải trình tự khác nhau. .......................................................................................... 9 Bảng 1.2. Danh sách các gene trong bộ gene lục lạp của loài N. nucifera ................. 13 Bảng 2.1. Danh sách và vị trí thu mẫu sen tại Huế ................................................... 51 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide các cặp mồi đặc hiệu cho một số vùng gene chỉ thị ... 54 Bảng 2.3. Ảnh hưởng của dung môi đến chiết tách cao tổng số từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm .................................................................................................................... 60 Bảng 2.4. Điều kiện tiến hành sắc ký cột cổ điển phân lập hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n-Bu hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ................................................................. 63 Bảng 2.5. Chương trình gradien dung môi sử dụng trong phân tích khối phổ MS/MS ...................................................................................................................... 65 Bảng 3.1. Kết quả phân tích đặc tính phân tử và đặc tính di truyền 10 vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế ........................................................... 71 Bảng 3.2. Kết quả vị trí thay đổi các biến thể nucleotide trong trình tự vùng gene chỉ thị matK giữa một số mẫu sen trồng tại Huế ....................................................... 73 Bảng 3.3. Kết quả phân tích đặc điểm di truyền 10 vùng gene và tổ hợp các vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế ............................................ 75 Bảng 3.4. Kết quả phân tích sự phân bố các mẫu sen về các kiểu đơn bội .............. 78 Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra tính trung lập giữa một số mẫu sen trồng tại Huế dựa trên các vùng gene và tổ hợp vùng gene chỉ thị ........................................................ 85 Bảng 3.6. Kết quả phân tích đặc tính di truyền giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng ........................................................................................................................... 86 Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra tính trung lập giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng 87 Bảng 3.8. Kết quả giá trị Fst giữa nhóm sen trắng và nhóm sen hồng ..................... 88 Bảng 3.9. Kết quả chiết cao tổng số, định tính alkaloid và flavonoid từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ......................................................................................................... 96 Bảng 3.10. Kết quả định lượng alkaloid và flavonoid trong cao tổng số và các cao phân đoạn tinh sạch thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ........................................ 97 Bảng 3.11. Kết quả tính chất của các hợp chất phân lập từ phân đoạn n-Bu của hạt Sen Trắng Trẹt Lõm .................................................................................................. 99 x Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ khối lượng của các hợp chất tinh khiết .............. 99 Bảng 3.13. Kết quả hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết tổng ethanol 70% thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ....................................................................... 104 Bảng 3.14. Kết quả hoạt tính bắt gốc tự do DPPH các hợp chất tinh khiết ........... 105 Bảng 3.15. Kết quả giá trị IC50 của các hợp chất tinh khiết ................................... 105 Bảng 3.16. Kết quả gây độc tế bào của cao chiết tổng ethanol 70% thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ................................................................................................ 107 Bảng 3.17. Kết quả giá trị IC50 của cao chiết tổng ethanol 70% thu được từ hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ....................................................................................................... 108 Bảng 3.18. Kết quả gây độc tế bào của các hợp chất tinh khiết ............................. 110 Bảng 3.19. Kết quả giá trị IC50 của các hợp chất tinh khiết ................................... 111 xi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Bản đồ hệ gene lục lạp của loài N. nucifera từ PacBio RS II. ................. 12 Hình 2.1. Bản đồ vị trí thu mẫu sen tại Huế ............................................................. 50 Hình 2.2. Hình thái hoa giống Sen Trắng Trẹt Lõm ..................................................... 53 Hình 2.3. Nguồn nguyên liệu hạt Sen Trắng Trẹt Lõm ............................................ 56 Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm PCR. ....................................................................... 68 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR.. ...................................................................... 69 Hình 3.3. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene chỉ thị ITS4-5 giữa một số mẫu sen .................................................................................................. 72 Hình 3.4. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene chỉ thị matK giữa một số mẫu sen trồng tại Huế ............................................................................ 74 Hình 3.5. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide các vùng gene chỉ thị giữa một số mẫu sen trồng tại Huế............................................................................ 77 Hình 3.6. Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene chỉ thị trnH- psbA giữa một số mẫu sen trồng tại Huế................................................................... 82 Hình 3.7. Cây quan hệ phát sinh dựa trên vùng gene chỉ thị ITS4-5 giữa một số mẫu sen trồng tại Huế ....................................................................................................... 89 Hình 3.8. Cây quan hệ phát sinh dựa trên tổ hợp 5 vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide giữa một số mẫu sen trồng tại Huế .......................................................... 91 Hình 3.9. Cây quan hệ phát sinh dựa trên tổ hợp 9 vùng gene chỉ thị lục lạp giữa một số mẫu sen trồng tại Huế .................................................................................... 92 Hình 3.10. Hình thái Sen Trắng Trẹt Lõm được trồng tại hồ Tịnh Tâm .................. 95 Hình 3.11. Kết quả định tính alkaloid và flavonoid.. ............................................... 97 Hình 3.12. Sắc ký đồ bản mỏng (TLC) của các hợp chất tinh khiết.. ...................... 98 Hình 3.13. Công thức hóa học của hợp chất nuciferine ......................................... 100 Hình 3.14. Công thức hóa học của hợp chất armepavine ....................................... 101 Hình 3.15. Công thức hóa học của hợp chất anonaine ........................................... 102 Hình 3.16. Các dòng tế bào ung thư khi thử nghiệm gây độc với chất thử với cao chiết tổng ethanol 70% ............................................................................................ 109 Hình 3.17. Các dòng tế bào ung thư khi thử nghiệm gây độc với chất thử là hoạt chất tinh khiết .......................................................................................................... 113 xii DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ Sơ đồ 1.1. Sơ đồ các bước chính thực hiện các nội dung đề tài luận án ................. 49 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thí nghiệm chiết tách, tinh sạch hợp chất ....