Luận án Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ DUY CƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ DUY CƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Khoa học y sinh Mã số: 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Nguyễn Lĩnh Toàn 2. PGS.TS. Hồ Anh Sơn HÀ NỘI, NĂM 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc! Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc Học Viện, Bộ môn Sinh lý bệnh, Viện nghiên cứu Y-Dược học quân sự, Phòng Sau đại học, Học viện Quân y đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học tế bào, khoa Sinh học và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym và Protein (KLEPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Hình thái, Viện 69, Bộ Tư Lệnh Lăng Chủ Tịch Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn, PGS.TS. Hồ Anh Sơn, những người thầy đã tận tình trực tiếp dạy dỗ, dìu dắt, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng đến các thầy cô trong hội đồng chấm luận án đã dành nhiều thời gian và công sức chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên, giúp đỡ vô tư, tận tình của các anh chị đi trước, đồng nghiệp, bạn bè trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn tới công ơn nuôi dạy của cha mẹ tôi, sự quan tâm giúp đỡ, động viên của vợ, con, anh, chị, em và bạn bè thân thiết để tôi có được ngày hôm nay. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Lê Duy Cương LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong đề tài nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu ứng dụng virus vaccine sởi và quai bị gây ly giải tế bào điều trị ung thu gan và đại trực tràng trên thực nghiệm”. Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên chính. Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Lê Duy Cương MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Giới thiệu chung ..................................................................................... 3 1.2. Ung thư đại trực tràng ............................................................................ 5 1.2.1. Tình hình ung thư đại trực tràng ...................................................... 5 1.2.2. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng ................................................ 6 1.2.3. Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng .................................. 7 1.3. Liệu pháp virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư đại trực tràng người ........................................................................................................... 22 1.3.1. Sinh học virus sởi và quai bị .......................................................... 22 1.3.2. Virus vaccine sởi và quai bị lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng ............................................................................................ 24 1.3.3. Các cơ chế virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại trực tràng ............................................................................................ 27 1.4. Các nghiên cứu virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư trên lâm sàng .............................................................................................................. 35 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 38 2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 38 2.1.1. Động vật ......................................................................................... 38 2.1.2. Chất liệu nghiên cứu ...................................................................... 38 2.1.3. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu .......................................... 38 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 40 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào .................... 40 2.2.2. Phương pháp tăng sinh và chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine ............................................................................. 42 2.2.3. Phương pháp đánh giá virus vavccine sởi và quai bị ly giải tế bào bằng thử nghiệm 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide ..................................................................................................... 45 2.2.4. Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và tế bào hoại tử bằng phương pháp dòng chảy ........................................................................... 48 2.2.5. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy ........................................................................................................... 51 2.2.6. Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) ........... 54 2.2.7. Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT- 29 trên dùi chuột thiếu hụt miễn dịch và tính kích thước khối u .............. 55 2.2.8. Phương pháp điều trị chuột nude bằng virus vaccine sởi và quai bị ....................................................................................................... 56 2.2.9. Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29..56 2.2.10. Phương pháp phẫu tích lấy mô u và lách chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ....................................................................................................... 57 2.2.11. Đánh giá tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi và quai bị bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy ....................................... 59 2.2.12. Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ............................................................. 61 2.2.13. Phương pháp phân tích kết quả ................................................... 62 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ................................................................................... 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 65 3.1. Tăng sinh dòng tế bào HT-29, Vero, virus vaccine sởi và quai bị .......... 65 3.1.1. Tăng sinh các dòng tế bào HT-29 và Vero ....................................... 65 3.1.2. Tăng sinh virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine ..... 66 3.2. Chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị theo phương pháp TCID50 ........ 67 3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro .......................................................................... 68 3.3.1. Tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị tạo hợp bào in vitro ........................................................................................................... 68 3.3.2. Kết quả đánh giá hiệu quả ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 của virus vaccine sởi và quai bị bằng nghiệm pháp 3- (4,5- Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide ........................ 69 3.3.3. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình và hoại tử sau nhiễm virus vaccine sởi và quai bị in vitro.73 3.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch ............................... 90 3.4.1. Kết quả ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ........ 90 3.4.2. Kết quả điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 bằng virus vaccine sởi và quai bị ....................................... 91 3.4.3. Tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột thiếu hụt miễn dịch ở các nhóm nghiên cứu sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ............. 96 3.4.4. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ........................................................ 99 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 101 4.1. Tăng sinh các dòng tế bào Vero và tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro ........................................................................................... 101 4.1.1. Tăng sinh dòng tế bào Vero ......................................................... 101 4.1.2. Nuôi cấy, tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 .. 102 4.2. Tăng sing virus vaccine sởi, quai bị và Chuẩn độ TCID50 ................ 103 4.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro ........................................................................................... 107 4.3.1. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp tế bào ung thư đại tràng người HT-29 bằng cách tạo hợp bào in vitro ............................... 107 4.3.2. Đánh giá khả năng ly giải tế bào HT-29 của virus vaccine sởi và quai bị bằng nghiệm pháp 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) - 2,5 diphenyl tetrazolium bromide ............................................................................... 109 4.3.3. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào HT-29 thông qua kích hoạt con đường tế bào chết theo chương trình in vitro ......................... 112 4.4. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch ....................................................... 123 4.4.1. Đánh giá độc tính của virus vaccine sởi và quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ....... 123 4.4.2. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch .......................................... 125 4.4.3. Virus vaccine sởi và quai bị kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch.128 4.4.4. Kết quả siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị ..................................................................................................... 134 KẾT LUẬN ................................................................................................... 140 1. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả ly giải trực tiếp và kích hoạt con đường chết tế bào apoptosis in vitro ở dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 .................................................................................... 140 2. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột nude........................139 KHUYẾN NGHỊ ........................................................................................... 142 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN ............................................................................ 143 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 144 DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT APC Adenomatous polyposis coli (Coli polyp tuyến) AIF Apoptosis inducing factor (yếu tố tạo ra chết tế bào theo chương trình) CEA Carcinoembryonic Antigen (kháng nguyên ung thư biểu mô phôi) CIMP CpG island methylator phenotype (kiểu hình methyl hóa đảo CpG) CPE Cytopathic effect (hiệu ứng gây độc tế bào) CpG Cytosine – Guanine nucleotide CRC Colorectal Cancer (ung thư đại trực tràng) DAMP Damage-Associated Molecular Pattern (kiểu phân tử liên quan đến các tổn thương) DC Dedritic Cell (tế bào đuôi gai) DNA Deoxyribonucleic acid F Fusion (hòa màng) HN H Hemagglutinin neuraminidase Hemagglutinin HNPCC Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (ung thư đại trực tràng di truyền không do Polyp) IFN Interferon IL Interleukin LINE-1 (Long interspersed nuclear elements-1) yếu tố nhân kích thước dài rải rác 1 LLC Lewis Lung Cancer (ung thư phổi chuột) MeV Mealse vaccine virus (virus vaccine sởi) MHC Major Histocompatibility Complex (phức hợp tương hợp mô chính) MMR Mismatch Repair (sửa chữa ghép đôi không xứng) MOI Multiplicity of infection MSI Microsatellite Instability (bất ổn trình tự lặp ngắn của DNA) MTT 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide MuV Mumps vaccine virus (virus vaccine quai bị) NIS Sodium-Iodine Symporter (chất mang iod natri) NK Natural Killer (giết tự nhiên) OV Oncolytic Virus (virus ly giải tế bào ung thư) PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern (kiểu phân tử liên quan đến tác nhân gây bệnh) PBS Phosphate buffered saline (dung dịch muối đệm phosphat) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) PFU Plaque forming units (Số hạt virus nhiễm vào một tế bào) RNA Ribonucleic acid ROS Reactive Oxygen Species (các gốc tự do chứa oxy hoạt động) TCID Tissue Culture Infectious Dose (liều nhiễm mô nuôi cấy) TGFβ Transforming Growth Factor β (yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β) TNF Tumor necrotic factor (yếu tố hoại tử khối u) Wnt Wingless-related integration (tên của con đường truyền tín hiệu vào nội bào thông qua các thụ thể trên bề mặt tế bào) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Các thử nghiệm lâm sàng của MeV và MuV36 3.1. Kết quả tạo khối u tế bào HT-29 trên đùi chuột nude...90 3.2. Kết quả theo dõi sức khỏe chuột sau điều trị MeV và MuV ............ 92 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1. KếT quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 3 ............ 69 3.2. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 4 ............. 70 3.3. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 5 ............. 71 3.4. So sánh kết quả MTT các nhóm MuV+MeV ngày 3, 4 và 5 ............ 71 3.5. So sánh kết quả MTT các nhóm MeV ngày 3, 4 và 5....................... 72 3.6. So sánh kết quả MTT các nhóm nhiễm MuV ngày 3, 4 và 5 ........... 72 3.7. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV ............. 74 3.8. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV ............. 74 3.9. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV .......... 75 3.10. Tỉ lệ tế bào HT-29 hoại tử ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV ............. 76 3.11. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV ............. 78 3.12. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV ............. 78 3.13. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV .......... 79 3.14. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 4 nhiễm MuV, MeV ........................ 80 3.15. Tỉ lệ tế bào apoptosis ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV .................... 82 3.16. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV ............. 82 3.17. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV .......... 83 3.18. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV ........................ 84 3.19. So sánh tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 3, 4 và 5 nhiễm MeV, MuV ........................................................................................ 86 3.20. So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis sớm ở ngày 3, 4 và 5 nhiễm MeV, MuV ............................................................................. 88 3.21. So sánh tỉ lệ tế bào giai đoạn apoptosis muộn ở ngày 3, 4 và 5 nhiễm MeV, MuV ............................................................................. 89 3.22. Thay đổi trọng lượng chuột sau điều trị bằng MeV, MuV ............... 92 3.23. Kết quả kích thước khối u (mm3) sau điều trị bằng MeV, MuV ...... 93 3.24. So sánh thời gian sống trung bình ở các nhóm chuột sau điều trị bằng MeV và MuV ........................................................................... 94 Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.25. Kết quả tỉ lệ chuột còn sống sau điều trị bằng MuV, MeV .............. 95 3.26. Kết quả tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột nude sau điều trị bằng MeV và MuV. .......................................................................... 98 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Gia đình Paramyxoviridae ................................................................ 23 1.2. MeV, MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào CRC ..................................... 25 1.3. MeV, MuV ly giải tế bào CRC trực tiếp và qua trung gian miễn dịch30 1.4. Vai trò sialidase của MeV, MuV hoạt hóa tế bào lympho T gây độc tế bào u. ...................................................................................... 35 2.1. Các máy sử dụng cho nghiên cứu..39 2.2. Nuôi cấy và tăng sinh tế bào trong phòng thí nghiệm ...................... 40 2.3. Sơ đồ nhiễm MeV, MuV để chuẩn độ TCID50 ................................. 43 2.4. Sơ đồ pha loãng nồng độ MeV, MuV ............................................... 44 2.5. Sơ đồ các nhóm nhiễm MeV, MuV làm nghiệm pháp MTT ............ 47 2.6. Bộ Kit làm nghiệm pháp MTT .......................................................... 47 2.7. Sơ đồ nhiễm MeV, MuV theo các nhóm đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và tế bào hoại tử in vitro ................................................... 49 2.8. Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACS Diva đánh giá tỉ tế bào apoptosis và tế bào hoại tử .......................... 53 2.9. Buồng nuôi chuột nude ..................................................................... 54 2.10. Ghép u tế bào HT-29 và đo kính thước u trên đùi chuột nude ......... 56 2.11. Mẫu xác định thông số chuẩn cho máy trên phần mềm BD FACS Diva đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột nude ............. 61 3.1. Tế bào HT-29 bám đáy và phát triển.65 3.2. Tế bào Vero bám đáy và phát triển ................................................... 65 3.3. Tế bào Vero nhiễm MeV, MuV ........................................................ 66 3.4. Kết quả nhuộm xanh methylen chuẩn độ TCID50 ............................. 67 3.5. Hình ảnh tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro ...... 68 3.6. Biến đổi hình thái của tế bào HT-29 chết theo chương trình. ........... 73 3.7. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 5 ............................................ 77 Hình Tên hình Trang 3.8. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 4 ............................................ 81 3.9. Kết quả phân tích dòng chảy các tế bào ung thư đại tràng người HT-29 nhiễm MeV, MuV ở ngày thứ 3