Luận án Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên 2. TS. Nguyễn Văn Cảm HÀ NỘI, 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Phạm Văn Sơn ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên và TS. Nguyễn Văn Cảm, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy mà luận án của tôi đã được hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Trân trọng cảm ơn nhóm các nhà Khoa học nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin vô hoạt phòng Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”. Thuộc chương trình KC-04 do PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm đã tạo điều kiện cho chúng tôi tham gia nhiều công đoạn nghiên cứu và cho phép tôi sử dụng một số kết quả nghiên cứu trong luận án này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và cơ quan mà tôi đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Phạm Văn Sơn iii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................................ iii Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................................... vii Danh mục bảng ................................................................................................................ ix Danh mục hình ................................................................................................................. xi Trích yếu luận án ........................................................................................................... xiv Thesis abstract ................................................................................................................ xvi Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................ 2 1.2.1. Mục tiêu chung...................................................................................................... 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ...................................................................................................... 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 2 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 2 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................... 3 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................. 3 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................................. 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................................................. 4 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 5 2.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn .................................................................. 5 2.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới .............................................. 5 2.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam ............................................. 8 2.2. Căn bệnh ............................................................................................................. 14 2.2.1. Cấu trúc virus PRRS ........................................................................................... 14 2.2.2. Phân loại virus PRRS .......................................................................................... 17 2.2.3. Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS......................................... 18 2.3. Truyền nhiễm học ............................................................................................... 19 2.3.1. Loài vật mắc bệnh ............................................................................................... 19 iv 2.3.2. Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây ..................................................... 19 2.3.3. Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây và đáp ứng miễn dịch ...................... 20 2.4. Triệu chứng và bệnh tích .................................................................................... 22 2.4.1. Triệu chứng lâm sàng .......................................................................................... 22 2.4.2. Bệnh tích ............................................................................................................. 23 2.5. Chẩn đoán và phòng trị bệnh .............................................................................. 24 2.5.1. Chẩn đoán ........................................................................................................... 24 2.5.2. Các biện pháp phòng trị bệnh ............................................................................. 25 2.6. Giống gốc trong sản xuất vacxin ........................................................................ 27 2.6.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 27 2.6.2. Cách chế tạo giống gốc ....................................................................................... 27 2.6.3. Cách quản lý giống gốc ....................................................................................... 27 2.6.4. Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV trong phòng thí nghiệm ............ 28 2.7. Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng PRRS .......................................................... 30 2.7.1. Sản xuất vacxin bằng phương pháp vô hoạt virus .............................................. 30 2.7.2. Sản xuất vacxin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trườngtế bào ............. 31 2.7.3. Phương pháp sản xuất vacxin thế hệ mới ........................................................... 32 Phần 3. Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................. 36 3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 36 3.2. Thời gian nghiên cứu .......................................................................................... 36 3.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 36 3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 36 3.4.1. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn ở những ổ dịch PRRS và thu thập mẫu ........... 36 3.4.2. Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV .............................................. 36 3.4.3. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS ............ 37 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 37 3.5.1. Phương pháp mổ khám ....................................................................................... 37 3.5.2. Phương pháp RT - PCR ...................................................................................... 37 3.5.3. Phương pháp làm tiêu bản vi thể ......................................................................... 40 3.5.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào .............................................................................. 41 3.5.5. Phương pháp nhân virus PRRS ........................................................................... 43 3.5.6. Phương pháp xác định hiệu giá virus .................................................................. 43 v 3.5.7. Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus ........................................ 43 3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen ............................................................................. 44 3.5.9. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein ..................... 45 3.5.10. Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột ......................................................... 45 3.5.11. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng) ............................................................................................................ 46 3.5.12. Phương pháp IPMA ............................................................................................ 47 3.5.13. Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống PRRS (master seed và working seed)... 48 3.5.14. Phương pháp kiểm tra thuần khiết của giống (master seed và workingseed) bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR ............................................................................... 50 3.5.15. Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 trên hệ thống Bioreactor .................. 50 3.5.16. Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng lọc tiếp tuyến ......................................... 50 3.5.17. Phương pháp vô hoạt virus ................................................................................. 51 3.5.18. Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt ...................................................................... 51 3.5.19. Phương pháp nhũ hóa vacxin .............................................................................. 52 3.5.20. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin ....................................... 52 3.5.21. Kiểm tra chỉ tiêu an toàn ..................................................................................... 53 3.5.22. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin ............................................ 53 3.5.23. Phương pháp Realtime RT-PCR ......................................................................... 54 3.5.24. Phương pháp ELISA ........................................................................................... 55 3.5.25. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu .................................................................. 56 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 57 4.1. Nghiên cứu một số biểu hiện bệnh lý của lợn mắc PRRS .................................. 57 4.1.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm .................................................................................... 57 4.1.2. Chẩn đoán PRRS bằng phương pháp RT-PCR ................................................... 58 4.1.3. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể ................................................................... 60 4.1.4. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể ..................................................................... 62 4.2. Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRS ..................................................... 65 4.2.1. Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 .................................. 65 4.2.2. Nghiên cứu sự ổn định một số đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam ......................................................................................... 71 4.2.3. Đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus PRRS ........................................ 79 vi 4.2.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus PRRS nghiên cứu ................................................................................................ 98 4.2.5. Sản xuất giống gốc ............................................................................................ 102 4.3. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS .......... 107 4.3.1. Nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin .................................................... 107 4.3.2. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS ................................... 109 4.3.3. Nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS ............................................... 115 Phần 5. Kết luận và kiến nghị .................................................................................... 123 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 123 5.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 123 Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án .......................................... 124 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 125 Phụ lục .......................................................................................................................... 137 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ BEI Binary Ethylenimine CSF Classical swine fever CPE Cytophathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EMCV Encephalomyocarditis virus ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum GP Glyco protein HE Haematoxylin – Eosin IFA Immunofluorescence assay IHC Immuno Histochemistry IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay KKT Kháng kháng thể MLV Modifier Live Vacine MOI Multiplicity Of Infection MSD Mystery Swine Disease NSP Non structural protein OD Optical Density OIE Office International des Epizooties ORF Open Reading Frame PAM Porcine Alveolar Macrophage PBS Photphat Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PCV2 Porcine circovirus type 2 PEDV Porcine epidemic diarrhea virus PEARS Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome viii Từ viết tắt Viết đầy đủ PPV Porcine parvovirus PPLO Pleuropneumonia-like organism PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRV Porcine Pseudorabies virus RNA Ribonucleic acid RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SIRD Swine Infertility and Respiratory Disease SIV Swine Influenza Virus S/P Sample/Positive SP Structural protein TAE Tris-acetate-EDTA TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGE Transmissible gastroenteritis TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine TPB Triptose phosphas broth ix DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Lịch sử phát hiện bệnh .......................................................................................... 6 2.2. Một số tên thường gặp trong các tài liệu .............................................................. 6 2.3. Protein cấu trúc của PRRSV ................................................................................. 7 2.4. Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016 ........................... 10 2.5. Cấu trúc và chức năng protein phi cấu trúc ........................................................ 16 2.6. Các vacxin đã thử nghiệm sản xuất .................................................................... 33 3.1. Thành phần phản ứng RT – PCR ........................................................................ 38 3.2. Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR: ....................................................... 38 3.3. Chu kỳ nhiệt trong máy PCR .............................................................................. 39 3.4. Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml .......................................................... 44 3.5. Chương trình chạy PCR giải trình tự .................................................................. 44 4.1. Số lượng mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được .............................................. 57 4.2. Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS..................................................... 59 4.3. Bệnh tích đại thể ở phổi lợn mắc PRRS ............................................................. 60 4.4. Bệnh tích đại thể ở một số khí quan khác của lợn mắc PRRS ........................... 60 4.5. Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi và hạch amidan của lợn mắc PRRS ............ 62 4.6. Bệnh tích vi thể ở gan, lách và thận của lợn mắc PRRS .................................... 63 4.7. Bệnh tích vi thể ở tim, hạch ruột và ruột của lợn mắc PRRS ............................. 63 4.8. Kết quả phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 .................... 65 4.9. Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được ........ 66 4.10. Kết quả lựa chọn các chủng virus PRRS xác định hiệu giá ............................... 67 4.11. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng PRRSV phân lập được ...................... 68 4.12. Các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên ................ 69 4.13. Kết quả lựa chọn sơ bộ các chủng virus PRRS cho nghiên cứu ......................... 72 4.14. Khả năng gây bệnh tích tế bào theo thời gian của các chủng virus qua 5 đời cấy chuyển .................................................................................................... 73 4.15. Hiệu giá của các chủng virus PRRS nghiên cứu qua 5 đờicấy chuyển .............. 75 4.16. Kết quả lựa chọn chủng virus PRRS để nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử ................................................................................................................ 79 x 4.17. Tương đồng nucleotide gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu ..................................................................................... 81 4.18. Tương đồng axit amin gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu ......... 83 4.19. Tương đồng nucleotide gen ORF7 của các