Luận án Nghiên cứu thành phần hóa hóa học và tác dụng sinh học của cây Gối hạc ( Leea rubra Blume ex Spreng., h Leeaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU N N T Ư N NGHIÊN CỨU T ÀN N C VÀ T C DỤN N C C C ẠC (Leea rubra ) LUẬN ÁN TIẾN Ĩ DƯỢC H C HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU N N T Ư N NGHIÊN CỨ T ÀN N C VÀ T C DỤN N C C C ẠC (Leea rubra ) LUẬN ÁN TIẾN Ĩ DƯỢC H C Chuyên ngành: Dược h c cổ truyền Mã số: 62 72 04 06 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TSKH. Nguyễn Minh Khởi 2. PGS.TS. ư T T ư HÀ NỘI - 2017 LỜ C M ĐO N Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TSKH. Nguyễn Minh Khởi và PGS.T hư ng Thi n Thư ng. Các số li u, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhi m về nghiên cứu của mình. Tác giả N ễ T ư LỜI CẢM N Luận án tiến sĩ này được thực hi n tại Vi n Dược li u dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TSKH. Nguyễn Minh Khởi và T hư ng Thi n Thư ng. Tôi xin bày tỏ lòng biết n sâu sắc nhất tới các thầy đã định hướng nghiên cứu, tận tình hỗ trợ, chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều ki n thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm n các nhà khoa học, các tác giả của những công trình khoa học đã trích dẫn trong luận án vì đã cung cấp nguồn tư li u quý báu, những kiến thức liên quan trong quá trình nghiên cứu hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm n Ban lãnh đạo, các Khoa, hòng và các đồng nghi p tại Vi n Dược li u, Trường Đại học Dược Hà Nội, Vi n Hàn lâm Khoa học và Công ngh Vi t Nam, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên-Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhi t tình giúp đỡ, tạo điều ki n và cộng tác để giúp tôi hoàn thành công trình này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm n tới G T Nguyễn Thị Bích Thu, TS. Nguyễn Thùy Dư ng, Ths Vũ Văn Tuấn đã có những ý kiến đóng góp quý báu giúp tôi hoàn thi n luận án. Cuối cùng xin cảm n những người thân yêu trong gia đình, cảm n những bạn bè thân thiết đã dành cho tôi những tình cảm, sự động viên chí tình trong suốt thời gian qua. N ễ T ư MỤC LỤC Mục lục Danh mục các ký hi u, chữ viết tắt Danh mục các hình, bảng Trang TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 9 Đ T V N Đ .................................................................................................................. 1 C Ư N T N N ........................................................................................... 3 1.1. TH C V T HỌC ................................................................................................... 3 Leea Royen ex L. ......... 3 Vị trí phân loại của chi Leea ....................................................................... 3 Đ c điểm thực vật của chi Leea. ................................................................. 4 hân bố của chi Leea. ................................................................................. 6 ác loài thuộc chi Leea và sự phân bố ở Vi t Nam ................................... 10 1.1.2. V trí phân lo m th c v t, phân b và sinh thái c rubra Blume ex Spreng. ........................................................................................... 12 1.1.2.1. Vị trí phân loại của cây Gối hạc................................................................ 12 Đ c điểm thực vật của cây Gối hạc. .......................................................... 12 1.1.2.3. Phân bố và sinh thái của cây Gối hạc. ....................................................... 13 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC .................................................................................. 13 1.2.1. Thành phần hóa học c a chi Leea. ................................................................. 13 1.2.1.1. Các hợp chất triterpenoid.......................................................................... 14 1.2.1.2. Các hợp chất flavonoid ............................................................................. 17 1.2.1.3. Các acid phenolic ..................................................................................... 20 1.2.1.4. Tinh dầu ................................................................................................... 22 1.2.1.5. Các nhóm hợp chất khác .......................................................................... 23 1.3. CÔNG DỤNG VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI LEEA ........................................................................................................................... 24 1.3.1. Công dụng c a các loài thuộc chi Leea trong y học cổ truyền ........................ 24 1.3.2. Tác dụng sinh học c a cao chiết và một s hợp chất phân l ược từ các loài thuộc chi Leea .......................................................................................................... 26 1.3.2.1. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, trừ giun sán ...................................... 26 1.3.2.2. Tác dụng chống oxy hóa ........................................................................... 27 1.3.2.3. Tác dụng độc tế bào và chống ung thư ...................................................... 28 1.3.2.4. Tác dụng chống tạo sỏi ............................................................................. 29 1.3.2.5. Tác dụng chống viêm, giảm đau ............................................................... 29 1.3.3. Một s công dụng và tác dụng sinh học c a cây G i h c Leea rubra Blume ex Spreng. ..................................................................................................................... 30 1.3.3.1. Tính vị, tác dụng ...................................................................................... 30 1.3.3.2. Công dụng ................................................................................................ 30 1.3.3.3. Tác dụng sinh học .................................................................................... 31 C Ư N Đ TƯỢN VÀ Ư N N N CỨ ............................ 33 2.1. ĐỐI TƯ NG NGHIÊN U ............................................................................... 33 .................................................................................. 33 ộ ....................................................................................... 33 ấ , dung môi ....................................................................... 33 2.2. HƯƠNG H P NGHIÊN U .......................................................................... 34 2.2.1. Nghiên c ề ọ ............................................................................. 34 ề ọ ................................................................................... 34 hư ng pháp định tính ............................................................................. 34 hư ng pháp phân lập các hợp chất .......................................................... 35 hư ng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ............................... 35 Định lượng một số hợp chất chính phân lập được từ Gối hạc .................... 36 ụ ượ .......................................................................... 38 2.2.3.1. Mẫu nghiên cứu........................................................................................ 38 Thiết bị s dụng trong nghiên cứu tác dụng sinh học ................................ 39 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ............................................................. 39 Đánh giá tác dụng ức chế sự hoạt động của enzym xanthin oxidase.......... 41 5 Đánh giá tác dụng chống viêm ................................................................. 41 Đánh giá tác dụng giảm đau ..................................................................... 46 Th hoạt tính ức chế n ym prot as HIV- của các cao chiết và một số hợp chất trit rp n phân lập được từ dược li u Gối hạc .......................................... 48 ư .............................................................................. 49 CHƯ N ẾT Ả N N CỨ ..................................................................... 50 3.1. TH C V T HỌC ................................................................................................. 50 3.1.1. Thẩ ọ ....................................................... 50 ............................................................................ 50 ọ .............................................................................................. 53 Đ c điểm vi phẫu thân .............................................................................. 53 3.1 Đ c điểm vi phẫu lá .................................................................................. 54 Đ c điểm giải phẫu rễ ............................................................................... 55 m bộ ược li u ................................................................................... 56 3.1.4.1 Đ c điểm bột thân .................................................................................... 56 3.1.4.2. Đ c điểm bột lá ........................................................................................ 57 Đ c điểm bột rễ ........................................................................................ 58 3.2. TH NH HẦN H A HỌC .................................................................................. 58 nh tính các nhóm chất hữ ..................................................................... 58 3.2.2. Chiết xuất và phân l p các hợp chất ............................................................... 60 3.2.2.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ lá Gối hạc..................................... 60 3.2.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ thân cây Gối hạc .......................... 64 X nh cấu trúc hóa học c a các hợp chất phân l p từ G i h c ................... 65 ượng các hợp chất chính phân l ược từ ược li u G i h c ............ 106 3.2.4.1. Khoảng tuyến tính và phư ng trình đường chuẩn .................................. 106 3 Đánh giá phư ng pháp phân tích ............................................................ 107 Định lượng acid gallic và europetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid trong mẫu dược li u Gối hạc ................................................................................................ 108 3.3. T C DỤNG SINH HỌC ..................................................................................... 110 3.3.1. Tác dụng ch ng oxy hóa ............................................................................... 110 3.3.2. Tác dụng c chế ho ộng c a enzym xanthin oxidase ................................ 111 3.3.3. Tác dụng ch ng viêm .................................................................................... 111 3.3.3.1. Tác dụng chống viêm in vitro ................................................................. 111 3.3.3.2. Tác dụng chống viêm in vivo .................................................................. 113 3.3.4. Tác dụng giả a cao G i h c ............................................................. 116 3.3.4.1. Tác dụng giảm đau trung ư ng của cao Gối hạc trên mô hình mâm nóng ........................................................................................................................... 116 3.3.4.2. Tác dụng giảm đau ngoại vi của cao Gối hạc trên mô hình gây đau qu n bằng acid acetic .................................................................................................. 117 ụ ế - ế ột s hợp chấ ượ ừ ược li u G i h c ......................................................... 119 C Ư N 4 ÀN ẬN ........................................................................................... 121 4.1. VỀ TH C V T HỌC ......................................................................................... 121 4.2. VỀ HÓA HỌC .................................................................................................... 122 4.2.1. Kết quả nh tính .......................................................................................... 123 4.2.2. Kết quả phân l nh cấu trúc c a các hợp chất .............................. 123 4.2.3. Kết quả ượng các hợp chất chính phân l ược từ ược li u G i h c 134 4.3. VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC ............................................................................... 134 4.3.1. Về tác dụng ch ng oxy hóa ........................................................................... 135 4.3.2. Về ho t tính c chế ho ộng enzym xanthine oxidase ................................. 136 4.3.3. Về ho t tính c chế ho ộng enzym 5-lipoxygenase ................................... 137 4.3.4. Về ho t tính c chế ho ộng COX .............................................................. 138 4.3.5. Về tác dụng giả ................................................................................... 140 4.3.6. Về tác dụng ch ng viêm in vivo .................................................................... 142 4.3.7. Về ho t tính c chế protease HIV-1 .............................................................. 146 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH .................................................................................... 149 KẾT LU N ............................................................................................................... 149 1. Về th c v t học ................................................................................................... 149 2. Về hóa học ......................................................................................................... 149 3. Về tác dụng sinh học .......................................................................................... 150 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 151 TÀ Ệ T M ẢO CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG B N N ĐẾN LUẬN ÁN PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT ARV: Anti retroviral drug therapy ABTS: 2,2 ’ - azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) APCI-MS: Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mas Spectrometry (Phổ khối lượng ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển) BuOH: Butanol CD: Circular Dichroism (Phổ lưỡng sắc tròn). COSY: Correlation Spectroscopy COX: Cyclooxygenase (COX-1; COX-2). DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO: Dimethylsulfoxid DPPH: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS: Electron Spray Ionization Mass Spectrometry (Phổ khối lượng ion hóa phun đi n t ) EtOAc: Ethyl acetat EtOH: Ethanol GHL: Cao ethanol chiết từ lá Gối hạc GHR: Cao ethanol chiết từ rễ Gối hạc GHT: Cao ethanol chiết từ thân Gối hạc HIV: Human Immunodeficiency Virus HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC: High Perfomance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hi u năng cao) HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence Hx: n-Hexan IC50: Inhibitory Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) IL: Interleukin IR: InfraRed (Hồng ngoại) L. rubra: Leea rubra LOX: Lipoxygenase IC50: Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid MeOH: Methanol MIC: Minimum Inhihitory Concentration (Nồng độ tối thiểu ức chế) Na CMC: Natri Carboxyl Methyl Cellulose NBT: Nitroblue Tetrazolium NMR: Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) NO: Nitric Oxide NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy OD: Optical D nsity (Độ hấp thụ quang) p: Probability (Xác suất) PBS: Phosphate Buffered Saline /ư: Phản ứng ROS: Reactive Oxygen Species (Các dạng oxy phản ứng) SD: tandard D viation (Độ l ch chuẩn) SE: Standard Error (Sai số chuẩn) SOD: Superoxid Dismutase TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TEAC: Trolox equivalent antioxidant capacity TNF: Tumor Necrosis Factor (Yếu tố hoại t khối u) TCA: Trichloroacetic acid UV: Ultraviolet (T ngoại) Vis: Visible (Khả kiến) XO: Xanthin Oxidase DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số đ c điểm khác nhau giữa họ Gối hạc và họ Nho . 4 Bảng 1.2. Phân bố của các loài thuộc chi Leea . 7 ả 1.3 ác loài thuộc chi Leea ở Vi t Nam........................................... 10 ả 1.4. hân bố một số loài thuộc chi Leea ở Vi t Nam................................. 11 Bảng 1.5. Kết quả định tính các nhóm chất của một số loài thuộc chi Leea...... 14 Bảng 1.6. ác trit rp noid đã phân lập từ các loài thuộc chi Leea ............... 15 Bảng 1.7. ác flavonoid đã phân lập từ các loài thuộc chi Leea ................... 18 Bảng 1.8. Các dẫn chất của acid b n oic đã phân lập từ các loài thuộc chi Leea...................................................................................................................... 21 Bảng 1.9. Các hợp chất sterol và megastigman đã phân lập từ các loài thuộc chi Leea................................................................................................................ 23 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất chính trong lá, thân và rễ cây Gối hạc bằng các phản ứng hóa học........................................................................... 59 Bảng 3.2. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 1...................................................... 65 Bảng 3.3. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 2...................................................... 67 Bảng 3.4. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 3...................................................... 68 Bảng 3.5. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 4...................................................... 70 Bảng 3.6. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 5...................................................... 73 Bảng 3.7. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 6...................................................... 74 Bảng 3.8. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 7...................................................... 76 Bảng 3.9. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 8...................................................... 79 Bảng 3.10. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 9.................................................... 80 Bảng 3.11. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 10.................................................. 81 Bảng 3.12. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 11.................................................. 81 Bảng 3.13. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 12.................................................. 84 Bảng 3.14. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 13.................................................. 85 Bảng 3.15. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 14.................................................. 88 Bảng 3.16. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 15.................................................. 89 Bảng 3.17. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 16.................................................. 91 Bảng 3.18. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 17.................................................. 93 Bảng 3.19. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 18.................................................. 95 Bảng 3.20. Dữ ki n phổ 1H-NMR của hợp chất 19............................................ 98 Bảng 3.21. Dữ ki n phổ 13C-NMR của hợp chất 19........................................... 99 Bảng 3.22. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 20.................................................. 103 Bảng 3.23. Dữ ki n phổ NMR của hợp chất 21.................................................. 105 Bảng 3.24. Kết quả phân tích acid gallic và europetin-3-O-α-L- rhamnopyranosid trong mẫu dược li u Gối hạc................................................. 108 Bảng 3.25. Tác dụng chống oxy hóa in vitro của các mẫu chiết từ cây Gối hạc 110 Bảng 3.26. Tác dụng ức chế sự hoạt động enzym xanthine oxidase của cao Gối hạc.............................................................................................................. 111 Bảng 3.27. Tác dụng ức chế sự hoạt động 5- LOX của các mẫu chiết từ cây Gối hạc........................................................................ 112 Bảng 3.28. Hoạt