Luận án Nghiên cứu thu nhận hoạt chất kìm hãm α-Glucosidaza từ Aspergillus oryzae và hướng ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TIẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC TIẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN HOẠT CHẤT KÌM HÃM α- GLUCOSIDAZA TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ HƯỚNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA 2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các Thầy Cô, bạn đồng nghiệp và các Cơ quan. Trước hết cho phép tôi bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Giáo Sư Tiến Sĩ Hoàng Đình Hòa, Phó Giáo Sư Tiến Sĩ Quản Lê Hà, là những người đã hướng dẫn, chỉ bảo, động viên và giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn Sở khoa học và Công nghệ Hà Nội đã cấp kinh phí cho tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn đến các Thầy cô của Viện Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm - Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận án. Tôi xin cảm ơn các đồng nghiệp đã cùng tôi làm việc và động viên giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các Giáo Sư, Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện và Ủy viên hội đồng đã dành nhiều thời gian quý báu để đọc và tham gia hội đồng chấm luận án này với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn tất tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời biết ơn đến bố mẹ, gia đình và người thân của tôi với tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ đã dành cho tôi trong chặng đường để hoàn thành được luận án nghiên cứu này. Tác giả luận án NGUYỄN ĐỨC TIẾN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tập thể giáo viên hướng dẫn 1. GS.TS. HOÀNG ĐÌNH HÒA 2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2015 Tác giả luận án NGUYỄN ĐỨC TIẾN MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................................ 1 2. Nội dung .............................................................................................................................. 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 3 4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận án ............................... 4 5. Bố cục luận án ..................................................................................................................... 5 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 6 1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) ............................................................................................. 6 1.1.1. Khái niệm ĐTĐ ............................................................................................................. 6 1.1.2. Phương pháp điều trị bệnh ĐTĐ ................................................................................... 7 1.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể ......... 8 1.2.1. Enzyme α-glucosidase ................................................................................................... 8 1.2.1.1. Sơ lược về enzyme....................................................................................................... 8 1.2.1.2. Giới thiệu về enzyme α - glucosidase ......................................................................... 8 1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ.................................................... 9 1.3. Chất kìm hãm α-glucosidase (alpha-Glucosidase inhibitor) (AGIs) .............................. 11 1.3.1. Các AGIs từ tổng hợp .................................................................................................. 12 1.3.2. AGIs từ động vật ......................................................................................................... 12 1.3.3. AGIs từ thực vật .......................................................................................................... 12 1.3.4. AGIs từ vi sinh vật ....................................................................................................... 14 1.3.5. AGIs từ A.oryzae ......................................................................................................... 15 1.4. Đỗ đen và các sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ ........................................................ 16 1.4.1. Đỗ đen ......................................................................................................................... 16 1.4.2. Sản phẩm lên men bề mặt từ đậu đỗ ............................................................................ 17 1.5. A.oryzae và lên men bề mặt ............................................................................................ 19 1.5.1. Đặc điểm hình thái A.oryzae ....................................................................................... 19 1.5.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae ................................................................................................................................. 21 1.5.2.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon .................................................................................. 22 1.5.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ....................................................................................... 23 1.5.2.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng .............................................................. 23 1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và hình thành AGIs bằng A.oryzae ................................................................................................................................. 24 1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................. 24 1.5.3.2. Độ ẩm môi trường .................................................................................................... 24 1.5.3.3. Ảnh hưởng độ thoáng khí ......................................................................................... 25 1.5.3.4. Điều kiện pH ban đầu của môi trường ..................................................................... 25 1.5.3.5. Tỷ lệ giống ................................................................................................................ 26 1.5.3.6. Thời gian lên men ..................................................................................................... 27 1.6. Thu nhận AGIs ............................................................................................................... 27 1.6.1. Chiết xuất AGIs từ sản phẩm môi trường sau lên men ............................................... 27 1.6.2. Tinh sạch AGIs ............................................................................................................ 29 1.7. Ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất ........................................................................ 30 1.8. Nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs từ đậu đỗ lên men trên thế giới ................ 35 1.9. Nghiên cứu và ứng dụng AGIs ở Việt Nam ................................................................... 39 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 41 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 41 2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu ................................................................................. 41 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................................... 41 2.1.3. Môi trường ................................................................................................................... 42 2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống ............................................................. 42 2.1.3.2. Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus ......................................................... 42 2.1.3.3. Môi trường đậu đỗ giá thể rắn ................................................................................. 42 2.1.3.4. Các môi trường rắn cho nhân giống ........................................................................ 42 2.1.3.5. Đỗ đen lên men ......................................................................................................... 43 2.1.4. Thiết bị ......................................................................................................................... 43 2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................................ 43 2.1.5.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................................. 43 2.1.5.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................................ 43 2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc ................................................................................... 44 2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc ........................................................... 44 2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ................................................................. 44 2.2.2.1. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men theo phương pháp của Yamaki và Mori (2006) ............................................................................. 44 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dịch chiết xuất bằng dung môi ...... 45 2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki và cộng sự, (1999) ...................................................................................................................... 45 2.2.2.4. Hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (giá trị IC50) ......................................................... 45 2.2.3. Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate và độ ẩm trong các sản phẩm thực phẩm .............................................................................................................................. 46 2.2.4. Phương pháp phân tích cảm quan ................................................................................ 46 2.2.5. Phương pháp tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs kỹ thuật ........... 47 2.2.6. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu an toàn thực phẩm .............................................. 47 2.2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ...................................................................... 47 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................ 48 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ......................................................................................... 48 2.3.2. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao .................................. 49 2.3.2.1. Phân lập A.oryzae..................................................................................................... 49 2.3.2.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ............................ 50 2.3.2.3. Định danh chủng nấm tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 ........................................................................................................................... 50 2.3.3. Xác định một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân giống trên môi trường rắn ...................................................................................................... 52 2.3.3.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 2.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 2.3.3.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 2.3.3.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 52 2.3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ................... 52 2.3.3.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ............................................................................................................................ 53 2.3.3.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6.................. 53 2.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 .............. 53 2.3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 .......................................................................................................... 53 2.3.4.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ cám gạo bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ........................................................................ 53 2.3.4.3. Ảnh hưởng của thành phần K2HPO4; KCL và MgSO4 bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................... 53 2.3.4.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54 2.3.4.5. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 .......................................................................................................... 54 2.3.4.6. Ảnh hưởng độ đầy khối môi trường lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54 2.3.4.7. Ảnh hưởng của lượng giống ban đầu lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ................................................................................................................... 54 2.3.4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành AGIs bằng A.oryzae T6 ........................................................................................................................................... 55 2.3.4.9. Sự biến động AGIs trong quá trình lên men bằng A.oryzae T6 ................................ 55 2.3.5. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm ................................. 55 2.3.5.1. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ............ 55 2.3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ........................................................................................................................................ 55 2.3.5.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và đỗ đen lên men đến khả năng chiết xuất AGIs ............................................................................................................................... 56 2.3.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men: ....................................................................................................................................... 56 2.3.5.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men ......................................................................................................... 56 2.3.6. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men ....................................................... 56 2.3.6.1. Khảo sát dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs ........................................................... 56 2.3.6.2. Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sạch sơ bộ AGIs ................................................ 57 2.3.6.3. Thu nhận AGIs .......................................................................................................... 57 2.3.6.4. Tinh sạch AGIs bằng RP - HPLC ............................................................................. 57 2.3.6.5. Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs bằng khối phổ ........ 57 2.3.6.6. Định lượng peptide AGIs bằng RP - HPLC ............................................................. 58 2.3.7. Ứng dụng AGIs ........................................................................................................... 58 2.3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs ...... 59 2.3.7.2. Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm AGIs ....................................................................................................................................... 59 2.3.7.3. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs ........................... 60 Với A: là T3; .......................................................................................................................... 61 2.3.8. Đề xuất công nghệ sản xuất chế phẩm AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6. ........................................................................................................................... 62 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 63 3.1. Tuyển chọn A.oryzae có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ..................................... 63 3.1.1. Phân lập Aspergillus oryzae ........................................................................................ 63 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao ............................... 64 3.1.3. Định danh chủng tuyển chọn được dựa trên so sánh trình tự gen vùng ITS1- 5,8S - ITS2 ..................................................................................................................................... 66 3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của A.oryzae T6 trong nhân giống trên môi trường rắn ....................................................................................................................... 68 3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6 ........................................................................................................................................... 68 3.2.2. Ảnh hưởng