Luận án Nghiên cứu thủy phân bã rong câu bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm

i BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ LÊ HƯƠNG THỦY NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU (Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT KHÁNH HÒA, 2017 ------------ ii BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ LÊ HƯƠNG THỦY NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU (Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 60.54.10.05 Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn PGS.TS. Vũ Ngọc Bội KHÁNH HÒA, 2017 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nha Trang, Ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lê Hương Thủy iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo Khoa Sau đại học và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho Thầy GS.TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn - nguyên Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang và PGS.TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Xin cám ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải sản và các cán bộ Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sau thu hoạch, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học, Xí nghiệp Giống thủy sản Hải Phòng, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án vừa qua. Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, Ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lê Hương Thủy v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................ix DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................xi DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................... xiii DANH MỤC BIỂU ĐỒ ...............................................................................................xiv TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ........................................... xv MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 1.1. Nguyên liệu rong biển và tình hình sản xuất Agar ............................................... 3 1.1.1. Nguyên liệu rong biển ................................................................................... 3 1.1.2. Các quy trình sản xuất agar ........................................................................... 4 1.1.3. Thành phần cơ bản của bã thải agar .............................................................. 8 1.1.4. Các phương pháp xử lý bã thải agar .............................................................. 9 1.2. Tổng quan về Cellulase ..................................................................................... 11 1.3. Enzym Cellulase ................................................................................................. 13 1.3.1. Định nghĩa và phân loại ............................................................................... 13 1.3.2. Tính chất ...................................................................................................... 14 1.3.3. Cơ chế thủy phân cellulose .......................................................................... 15 1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase...................................................................... 16 1.4. Vi sinh vật tổng hợp Cellulase ........................................................................... 18 1.4.1. Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase ..................... 18 1.4.2. Một số chủng vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất cellulase ... 22 1.4.3. Ứng dụng của enzym cellulase vi sinh vật .................................................. 24 1.4.4. Môi trường nuôi cấy và nguồn nguyên liệu ................................................ 26 1.4. 5. Phương pháp thu nhận enzym cellulase ..................................................... 27 1.5. Sản lượng nuôi cá rô phi ..................................................................................... 30 1.6. Đặc điểm sinh học của cá rô phi ......................................................................... 32 vi 1.6.1. Phân loại ...................................................................................................... 32 1.6.2. Đặc điểm hình thái: ..................................................................................... 32 1.6.3. Đặc điểm về dinh dưỡng và sinh trưởng. .................................................... 33 1.6.4. Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi ............................................................... 34 1.6.5. Nhu cầu dinh dưỡng và ảnh hưởng của thức ăn lên sinh trưởng của cá rô phi. ......................................................................................................................... 38 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 42 2.1. Đối tượng ............................................................................................................ 42 2.1.1. Bã thải rong sau sản xuất agar ..................................................................... 42 2.1.2. Giống vi sinh vật sinh cellulase ................................................................... 42 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 43 2.2.1. Phương pháp phân tích ................................................................................ 43 2.2.2. Các phương pháp thu nhận và xác định hoạt tính cellulase ........................ 44 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật ................................................................................................................... 47 2.2.4. Phương pháp xây dựng mô hinh thực nghiệm ............................................ 50 2.3. Hóa chất và thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án ................................................ 57 2.3.1. Hóa chất ....................................................................................................... 57 2.3.2. Thiết bị ......................................................................................................... 57 2.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 58 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 59 3.1. Khảo sát đánh giá khối lượng và thành phần hóa học cơ bản của bã thải rong câu chỉ vàng sau sản xuất agar ......................................................................................... 59 3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các chủng vi sinh vật tuyển chọn ..................................................................................... 61 3.2.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật ...................... 61 3.2.2. Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các chủng vi sinh vật tuyển chọn .... 65 3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B. Subtilis VTCC B-505 và B. Lichenformis (Li) và ứng dụng thủy phân bã rong câu (G. Verrucosa) sau sản xuất Agar .............................................................................. 72 3.3.1. Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sản xuất enzyme cellulase từ 2 chủng B505 và Li ........................................................................................... 72 vii 3.3.2. Đề xuất quy trình nuôi cấy và thu nhận chế phẩm cellulase thô ................. 80 3.3.3. So sánh đánh giá hoạt tính cellulase của chủng Li và B505 với chế phẩm cellulase từ các VSV khác ..................................................................................... 84 3.3.4. Nghiên cứu thủy phân bã thải rong sau sản xuất agar bằng enzyme cellulase từ hai chủng vi khuẩn B 505 và Li ........................................................................ 88 3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong trong thức ăn nuôi cá rô phi .............................................................................................................................. 95 3.4.1. Xây dựng công thức thức ăn nuôi cá rô phi ................................................ 95 3.4.2. Đề xuất quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi ....................................... 97 3.4.3. Điều kiện môi trường nuôi thử nghiệm cá rô phi ...................................... 100 3.4.4. Thử nghiệm nuôi cá rô phi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm thủy phân bã rong ............................................................................................................................. 104 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 108 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................................................................................................................... 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 111 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A530 : Đo OD ở bước sóng 530nm B26 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-26 B505 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505 CMC : Carbonyl – methyl cellulose CMCase : Carbonyl – methyl cellulase CPF Thailand : Tập đoàn Nông sản Charoen Pokphand Thái Lan ĐC : Đối chứng DNSA : 2 –hydroxyl – 3,5 dinitrobenzoic acid DO : Hàm lượng oxy hòa tan DWG : Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ Chức Liên Hiệp Thế Giới về Lương Thực và Nông Nghiệp) FCR : Feed convertion ratio (Hệ số chuyển đổi thức ăn) K-Na : TartratePotassium Sodium Tartrate Tetrahydrate Li : Vi khuẩn Bacillus lichenformis NT : Nghiệm Thức Nxb : Nhà xuất bản OD : Optical Density ( mật độ quang học) TCA : Tricloacetic axit TLS : Tỷ lệ sống TM & SX : Thương mại và sản xuất TNHH : Trách nhiệm hữu hạn USD : Đô la Mỹ VSV : Vi sinh vật Wt : Khối lượng cá ứng với thời điểm t ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Vi sinh vật phân hủy lignocellulose ................................................................ 19 Bảng 1.2. Các vi khuẩn có hoạt tính cellulase riêng cao nhất (µmol/phút/mg) .............. 20 Bảng 1.3. Phân biệt cá đực, cá cái .................................................................................. 32 Bảng 1.4. Giới hạn các thành phần trong thức ăn có giá thành ít nhất cho cá rô phi ở các giai đoạn ................................................................................................................ 35 Bảng 1.5. Cung cấp bổ sung vitamin và khoáng chất trong thức ăn của cá rô phi .......... 36 Bảng 1.6. Tiêu chuẩn kỹ thuật của thức ăn nuôi cá rô phi và chế độ ăn trong nuôi lồng và ao thâm canh .................................................................................................... 37 Bảng 1.7. Thành phần hoá học cá rô phi nuôi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein 34,2 (%) ................................................................................................................ 40 Bảng 1.8. Nuôi cá rô phi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein (%) khác nhau. ....... 40 Bảng 1.9: Nuôi cá rô phi với tỷ lệ thức ăn (%)/thân khác nhau ...................................... 41 Bảng 2.1. Xây dựng đường chuẩn glucose ...................................................................... 46 Bảng 3.1. Khối lượng bã thải rong sau sản xuất agar từ các vùng rong nguyên liệu khác nhau ....................................................................................................................... 59 Bảng 3.2. Hàm lượng các chất cơ bản trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar ............................................................................................................................... 60 Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại nặng trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar ............................................................................................................................... 60 Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của 17 chủng vi sinh vật nghiên cứu ............... 62 Bảng 3.5. Hoạt tính enzym cellulase của chủng Li, B505, B26 và CFd ......................... 63 Bảng 3.6. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li, B505 trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2% ........................................................................................................ 69 Bảng 3.7. Khả năng thủy phân bã thải agar bằng cellulase từ 2 chủng Li và B505 ........ 70 Bảng 3.8. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi trong các môi trường khác nhau ..................................................................................... 73 Bảng 3.9. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li nuôi cấy ở các môi trường khác nhau ........................................................................................... 73 Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các nhiệt độ khác nhau ................................................................................................ 76 x Bảng 3.11. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase của chủng B505 và chủng Li ở các pH khác nhau .............................................................................................................. 77 Bảng 3.12. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian nuôi cấy ................................................................................................................. 78 Bảng 3.13. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 theo thời gian nuôi cấy ......................................................................................................... 79 Bảng 3.14. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505 và T3) trên đĩa thạch có CMC 0,2% .......................................................................... 85 Bảng 3.15. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505 và T3) trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2% .................................................... 87 Bảng 3.16. Kết quả thí nghiệm của mô hình Box-Behnken ............................................ 89 Bảng 3.17. Kết quả xử lý số liệu trên phần mềm DX6 .................................................... 89 Bảng 3.18. Kết quả dự đoán tối ưu cho tỷ lệ Naa/Nts theo mô hình Box-Behnken .......... 91 Bảng 3.19. Kết quả kiểm chứng tối ưu theo tiên đoán và thực nghiệm .......................... 92 Bảng 3.20. Thành phần hóa học của các nguyên liệu phối trộn ...................................... 95 Bảng 3.21. Thành phần nguyên liệu của các công thức thức ăn phối trộn bã rong thủy phân. ...................................................................................................................... 99 Bảng 3.22. Dao động các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm ..................... 101 Bảng 3.23. Ảnh hưởng của công thức thức ăn đến sinh trưởng của cá rô phi trong 80 ngày nuôi ...................................................................................................................... 104 xi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen ...................................... 11 Hình 1.2. Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật ......................... 12 Hình 1.3. Cơ chế tác động của enzym cellulase ........................................................... 17 Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose ............................................................................ 17 Hình 1.5. Hình dạng nấm mốc A. niger ......................................................................... 23 Hình 1.6. Hình dạng nấm Trichoderma viride ............................................................. 23 Hình 2.1. Bã thải sau sản xuất agar ............................................................................... 42 Hình 2.2. Cá rô phi ........................................................................................................ 43 Hình 2.3. Bố trí các giai nuôi thử nghiệm cá rô phi ...................................................... 55 Hình 3.1. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân CMCcủa 4 chủng vi sinh vật lựa chọn trên đĩa thạch chứa 1% CMC ....................................................................... 63 Hình 3.2. Điện di đồ chế phẩm cellulase thô thu nhận từ vi khuẩn B505 và Li trên gel polyacrylamis 12,5 % theo hệ đệm Laemmi ........................................................ 68 Hình 3.3. So sánh vòng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn Li, B505 trên đĩa thạch bổ sung cơ chất bột giấy 0,2% ................................................................................... 69 Hình 3.4. Khả năng thủy phân bã thải agar của cellulase ngoại bào từ chủng Li và B505 ..... 71 Hình 3.5. Khả năng thủy phân bã thải agar của hỗn hợp cellulase ngoại bào từ 4 chủng (B505, B26, Li, CFd) ............................................................................................ 71 Hình 3.6. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng B505 nuôi trong các môi trường khác nhau .................................................................................................. 72 Hình 3.7. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng vi khuẩn Li nuôi trong các môi trường khác nhau ..................................................................................... 74 Hình 3.8. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các nhiệt độ khác nhau ................................................................................................ 75 Hình 3.9. Vòng hoạt tính cellulase của chủng B505 và chủng Li nuôi cấy ở các pH khác nhau .............................................................................................................. 77 Hình 3.10. Đường kính vòng thủy phân của cellulase từ Li, B505 và T3 trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2% ........................................................................................... 84 Hình 3.11. Đường kính vòng thủy phân cellulase từ Tricoderma trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2 % .................................................................................................... 85 Hình 3.12. Hoạt tính cellulase Aspergillus trên đĩa thạch có