Luận án Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NCS. PHẠM THỊ TRANG 1 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMIASIS) Ở ĐÀN TRÂU TẠI TỈNH TUYÊN QUANG LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - NĂM 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NCS. PHẠM THỊ TRANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMIASIS) Ở ĐÀN TRÂU TẠI TỈNH TUYÊN QUANG Ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học thú y Mã số: 9640104 LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Nguyễn Thị Kim Lan 2. PGS. TS. Phạm Công Hoạt THÁI NGUYÊN - NĂM 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các kết quả nghiên cứu trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ một luận án nào khác. Mọi thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành Luận án đều đã được cảm ơn. TÁC GIẢ Phạm Thị Trang ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Nguyễn Thị Kim Lan và PGS. TS. Phạm Công Hoạt - những Nhà khoa học đã hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện to lớn về cơ sở vật chất, nhân lực, vật lực của Ban Giám đốc, Ban Đào tạo - Đại học Thái Nguyên; Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi thú y, Bộ môn Bệnh động vật, Bộ môn Dược lý & Vệ sinh an toàn thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tập thể cán bộ giảng dạy, các học viên cao học Trần Nhật Thắng, Nguyễn Thị Thu Hiền, Hoàng Thị Hồng Hạnh và sinh viên các khóa 39, 40, 41, 42 Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên. Đặc biệt, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Thị Tâm cùng các cán bộ giảng viên, học viên và sinh viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở - Hà Nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian triển khai đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn Chi cục Thú y tỉnh Tuyên Quang, các Trạm Thú y và cán bộ, nhân dân địa phương của các huyện Yên Sơn, Sơn Dương, Hàm Yên và Chiêm Hóa - tỉnh Tuyên Quang đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình và bạn bè đã luôn ở bên tôi, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Thái nguyên, ngày tháng năm 2017 NGHIÊN CỨU SINH Phạm Thị Trang iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .........................................................................................................i MỤC LỤC .................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ viii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................... 3 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................ 3 4. Những đóng góp mới của đề tài ........................................................................... 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài ................................................................................. 4 1.1.1. Bệnh tiên mao trùng ở động vật ............................................................................. 4 1.1.2. Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên của tiên mao trùng T. evansi .......................................................................................................................... 12 1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ..................................................... 20 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................................... 20 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ..................................................................... 24 1.3. Điều kiện tự nhiên, điều kiện kinh tế - xã hội của tỉnh Tuyên Quang ............ 35 1.3.1. Điều kiện tự nhiên ................................................................................................. 35 1.3.2. Điều kiện kinh tế - xã hội...................................................................................... 36 Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 38 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu ..................................................... 38 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 38 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 38 2.1.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................... 38 2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 43 2.2.1. Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị ................................................................................. 43 iv 2.2.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang ............................................................. 44 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 45 2.3.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị ..................................................................... 45 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh ....................................... 51 2.4. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 64 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................... 65 3.1. Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả ......................................................... 65 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang ................. 65 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang ................ 67 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt ................................................. 71 3.1.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ .................................................. 72 3.1.5. Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang .................................................................................................................. 75 3.1.6. Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang .................................................................................................................. 80 3.2. Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang ...................................................... 83 3.2.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của T. evansi ................................................................................................ 83 3.2.2. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi .................. 95 3.2.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ................................................................................................................ 108 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 131 1. Kết luận ............................................................................................................ 131 2. Đề nghị ............................................................................................................. 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 133 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ................ 148 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ADN: Acide Deoxyribo Nucleic bp: base pair CATT: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis CBB: Coomassie Brilliant Blue DMSO: Di Methyl Sulfoxide EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetic acid IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside ISG: Invanant Surface Glycoprotein kb: kilobase kDa: kiloDalton LB: Luria Bertani OD: Optical Density PBS: Phosphat Buffered Saline PCA: Plate Count Agar PCR: Polymerase Chain Reaction PMSF: Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride PVDF: Poly Vinylidene Di Fluoride RT - PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SDS: Sodium Dodecyl Sulfat SDS - PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis spp.: Species pluralis TEA: Tris - axit acetic - EDTA TMB: Tetra Methyl Benzidine VAT: Variable Antigen Type VSG: Variant Surface Glycoprotein vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần gel Tricine - SDS ................................................................... 41 Bảng 2.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ..................................................... 42 Bảng 2.3. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR ........................................... 48 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 ..................................................................................... 54 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng Klewnov cắt đầu bằng sản phẩm PCR ................ 54 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng lai tạo vector tái tổ hợp .......................................... 55 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp mồi F1.2 và R1.2 .......................................... 57 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector biểu hiện .......... 58 Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang ........ 65 Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi trâu ................................................. 68 Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt ....................................... 71 Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa trong năm ............................ 72 Bảng 3.5. Danh sách chuỗi gen 18S của Trypanosoma evansi sử dụng so sánh và phân tích trong nghiên cứu .................................................................... 78 Bảng 3.6. Kết quả áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp ........ 80 Bảng 3.7. Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng ............. 82 Bảng 3.8. Bảng tổng hợp kết quả so sánh trình tự xác định với các trình tự trên NCBI ....... 92 Bảng 3.9. Kết quả xác định mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex ........................................................... 111 Bảng 3.10. Kết quả xác định nhiệt độ và thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex ...................................................................................... 112 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chất nhuộm màu đến khả năng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể .................................................................................... 113 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất ức chế phân giải protein đến kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 ................................................................... 115 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất ổn định protein đến kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 ................................................................................ 117 vii Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất diệt khuẩn đến kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 ......................................................................................... 118 Bảng 3.15. Xác định độ pha loãng kháng thể, thời gian và nhiệt độ phản ứng ....... 121 Bảng 3.16. Kết quả phản ứng sử dụng Kit CATT phát hiện kháng thể kháng ........ 125 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy của phản ứng khi sử dụng Kit CATT .............................................................. 127 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến độ đặc hiệu của Kit CATT chế tạo ..................................................................................... 127 Bảng 3.19. So sánh kết quả chẩn đoán bệnh tiên mao trùng của Kit CATT với kỹ thuật ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột ................................. 128 Bảng 3.20. So sánh hiệu quả sử dụng Kit CATT với kỹ thuật ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột ............................................................................. 129 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của tiên mao trùng T. evansi ......................................................... 4 Hình 1.2. Phương thức truyền lây tiên mao trùng T. evansi ....................................... 5 Hình 1.3. Sơ đồ vector pCR 2.1 ................................................................................ 17 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi ................................................................................. 51 Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT từ kháng nguyên tái tổ hợp của T. evansi ............................................................................ 52 Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang ............................................................................................ 66 Hình 3.2. Đồ thị biến động nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi ..................... 68 Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt .......................... 71 Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa trong năm ............... 73 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen 18S của các mẫu Trypanosoma spp. trên thạch agarose 1% ...................................................................... 75 Hình 3.6. Hình ảnh chuyển nạp sản phẩm PCR của mẫu Tev-CH-VN; Tev- HY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN vào tế bào E. coli chủng DH5α-T .................................................................................................... 76 Hình 3.7. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid tái tổ hợp mang gen 18S bằng enzyme EcoRI .......................................................................... 77 Hình 3.8. Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide chuỗi gen 18S rRNA của các mẫu Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN nghiên cứu với các mẫu Trypanosoma evansi đã được đăng ký trong Ngân hàng gen ......................................................................................... 79 Hình 3.9. Kết quả điện di ADN tổng số .................................................................... 83 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu ADN tổng số .......................... 84 Hình 3.11. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................ 85 Hình 3.12. Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2 - RoTAT 1.2 ........................... 87 ix Hình 3.13. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trường LB có ampicillin, chất chỉ thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG .......................... 88 Hình 3.14. Kết quả tách chiết ADN plasmid pJET1.2 - RoTAT 1.2 ........................ 89 Hình 3.15. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR ....................... 90 Hình 3.16. Kết quả kiểm tra pJET1.2 - RoTAT 1.2-1 bằng EcoRI và SalI .............. 91 Hình 3.17. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của đoạn gen đích RoTAT 1.2 ............................................................................................... 92 Hình 3.18. Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt bằng hai enzyme EcoRI và SalI .......... 94 Hình 3.19. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21 ............................................................................. 95 Hình 3.20. Kết quả tách chiết ADN plasmid pET22 - RoTAT 1.2 ........................... 95 Hình 3.21. Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 .......... 96 Hình 3.22. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 ................. 97 Hình 3.23. Kết quả điện di Tricine-SDS PAGE các dòng plasmid tái tổ hợp ........ 99 Hình 3.24. Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein RoTAT 1.2 ........ 99 Hình 3.25. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 theo thời gian cảm ứng ....... 100 Hình 3.26. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nhiệt độ nuôi cấy ....... 101 Hình 3.27. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị OD khác nhau .. 102 Hình 3.28. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị pH khác nhau .... 103 Hình 3.29. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ kháng sinh ampicillin bổ sung khác nhau ......................................................... 104 Hình 3.30. Kết quả khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau ... 105 Hình 3.31. Kết quả khảo sát thời gian cảm ứng ...................................................... 106 Hình 3.32. Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng ...................................................... 107 Hình 3.33. Quy trình sản xuất Kit CATT .............................................................. 109 Hình 3.34. Đánh giá hiệu quả kết hợp kháng nguyên - kháng thể dựa trên thang điểm từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) và dương tính (1+) - (4+) .... 110 Hình 3.35. Quy trình chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng Kit CATT và phương pháp tiêm truyền chuột ............................................................. 129 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh tiên mao trùng là bệnh phổ biến ở nhiều loài gia súc như trâu, bò, dê, ngựa, hươu, lạc đà Elshafie E. I. và cs. (2013) [54], Kocher A. và cs. (2015) [66], Tehseen S. và cs. (2015) [116] cho biết, bệnh do Trypanosoma evansi (T. evansi) - ký sinh trùng đường máu, thuộc giới động vật nguyên sinh Protozoa, lớp trùng roi Flagellata, giống Trypanosoma gây nên. Bệnh thấy ở hầu hết các nước châu Phi, Nam Mỹ và châu Á. Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy phổ biến ở khắp các vùng, miền. Alves F. M. và cs. (2011) [35] cho biết, bệnh tiên mao trùng do đơn bào T. evansi gây ra, nếu chẩn đoán và điều trị không kịp thời gia súc có thể chết, gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết hiện nay là phải tìm ra một phương pháp chẩn đoán bệnh nhanh, độ chính xác cao, chi phí thấp, dễ dàng áp dụng trên phạm vi rộng để có thể điều trị kịp thời, giảm tỷ lệ chết do bệnh gây ra. Hiện nay, nước ta đã sử dụng nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng như phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, phương pháp tập trung tiên mao trùng, phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm, chẩn đoán huy