Luận án Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN TUẤN HẢI PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TẠO KHÁNG SINH TRONG ĐẤT RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 94 20 201 2024 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN TUẤN HẢI MÃ SỐ NCS: P0918002 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TẠO KHÁNG SINH TRONG ĐẤT RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 94 20 201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN GS.TS. CAO NGỌC ĐIỆP 2024 iii CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG Luận án này với tựa đề là “Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ chí Minh”, do nghiên cứu sinh Nguyễn Tuấn Hải thực hiện theo sự hướng dẫn của GS.TS. Cao Ngọc Điệp. Luận án đã báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thông qua ngày: ../../ 20. Luận án đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại. Thư ký Ủy viên Ủy viên Phản biện 3 Phản biện 2 Phản biện 1 Người hướng dẫn Chủ tịch hội đồng GS.TS. Cao Ngọc Điệp iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận án này, tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ và hỗ trợ thật quý báu của nhiều người. Xin được bày tỏ lòng tri ân chân thành và sâu sắc! Lời cảm ơn đầu tiên xin được gửi đến Thầy tôi, GS.TS. Cao Ngọc Điệp. Thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ dạy các phương pháp tiếp cận khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án tiến sĩ. Kế đến, tôi chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học (nay là Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm) đã truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức quý báu, phục vụ quá trình nghiên cứu và viết các báo cáo khoa học. Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác củaTrường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sài Gòn, Ban Lãnh đạo Khoa Môi Trường - Trường Đại học Sài Gòn đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Chân thành gửi lời cảm ơn đến các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Cần Thơ và Khoa Môi Trường - Trường Đại học Sài Gòn đã quan tâm, giúp đỡ và động viên, chia sẻ khó khăn với tôi. Chân thành cảm ơn các thầy cô và anh chị chuyên viên tại các phòng thí nghiệm liên quan cũng như các em sinh viên, các anh chị đồng học nghiên cứu sinh tại Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Cần Thơ đã cộng tác cùng tôi trong thời gian thực hiện các thí nghiệm. Đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS.Trần Thị Giang, phòng thí nghiệm Vi sinh môi trường, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm Trường Đại học Cần Thơ, người đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình triển khai và thực hiện nghiên cứu. Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, những người thân trong gia đình, đã hết lòng ưu ái, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian đi lại học tập giữa hai thành phố lớn. Nguyễn Tuấn Hải v TÓM TẮT Rừng ngập mặn có vai trò sinh học quan trọng. Vi khuẩn sợi là nguồn cung cấp kháng sinh và các hoạt chất sinh học ứng dụng rộng rãi. Đề tài “Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ chí Minh” phân lập, chọn lọc và phân tích hoạt chất kháng khuẩn của những chủng vi khuẩn sợi từ đất ngập mặn Cần Giờ. Đề tài phân lập đuợc 48 chủng vi khuẩn sợi, chọn được 8 chủng có tính kháng khuẩn, nhận diện dựa vào trình tự đoạn gen 16S rDNA. Kết quả đều là vi khuẩn Gram dương thuộc chi Streptomyces, họ Streptometaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành Actinobacteria; với 8 loài khác nhau: Streptomyces tendae, S. tanashiensis, S. parvulus, S. celluloflavus, S. aegytia, S. africanus, S. albogriseolus và S. laurentii. Có 3 chủng (Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. parvulus ANTHOIDONG 3.1) kháng được 4 vi khuẩn gây bệnh cho người là Bacillus cereus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus và Staphylococcus aureus. Tỷ lệ hiện diện của gen chỉ thị kháng sinh, 8/8 chủng vi khuẩn sợi đều mang gen nrps, 4/8 chủng mang gen pksI, đặc biệt là 50% các chủng mang cả 2 gen nrps và pksI. Chọn được 2 dòng vi khuẩn sợi tạo kháng sinh hay kháng các vi khuẩn gây bệnh tốt nhất (S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1) để trích ly hoạt chất bằng ethyl acetate, thu được cao chiết chứa hoạt chất ức chế 3 vi khuẩn gây bệnh cho người là Bacillus cereus, Escherichia coli, và Staphylococcus aureus; sử dụng kỹ thuật GC- MS phân tích thành phần hoạt chất. Cao chiết của chủng S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 xác định được 6 hoạt chất sinh học tiêu biểu như: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; Tetracosamethyl, cyclododecasiloxane. Chủng S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 phát hiện được 7 hoạt chất tiêu biểu, bao gồm: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl (hai chất Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl và Heptasiloxane, hexadecamethyl xuất hiện ở cả hai chủng), hợp chất Siloxane được xác định tính kháng khuẩn. Các chất này được tài liệu quốc tế ghi nhận tính kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa. Hoạt chất sinh học của hai dòng vi khuẩn sợi giữ được tính kháng khuẩn sau quá trình xử lý dung môi, mở ra khả năng ứng dụng vào sản xuất thành thuốc đồng thời là cơ sở để khai thác nguồn dược liệu tiềm năng từ vi khuẩn sợi của đất rừng ngập mặn, góp phần tăng hiệu quả trị bệnh ở người. Như vậy, loài vi khuẩn sợi và sinh chất hiện diện đất ngập mặn Cần Giờ tương đồng với các vùng ngập mặn trên thế giới. Từ khóa: gen nrps, kháng sinh, rừng ngập mặn Cần Giờ, Streptomyces, vi khuẩn sợi vi ABSTRACT Mangrove forests play an important biological role. Actinobacteria are a source of antibiotics and other useful substances. This thesis "Isolation and selection of antibiotic-producing Actinobacteria from Can Gio mangrove soil, Ho Chi Minh city" isolated, selected and analyzed antibacterial ingredients of actinobacterial strains from Can Gio mangrove soil. The project isolated 48 strains, selected 8 strains with antibacterial properties, and identified them based on the 16S rDNA gene fragment sequence. All such strains belong to the genus Streptomyces, family Streptometaceae, order Actinomycetales, class Actinobacteria, phylum Actinobacteria, and Gram-positive bacteria, with 8 species: Streptomyces tendae, S. tanashiensis, S. parvulus, S. celluloflavus, S. aegytia, S. africanus, S. albogriseolus and S. laurentii. Among them, 3 strains (Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 and Streptomyces parvulus ANTHOIDONG 3.1) were resistant to 4 human pathogens Bacillus cereus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus and Staphylococcus aureus. The presence of antibiotic genes, 8/8 actinobacteria strains carry nrps gene, 4/8 strains carry pksI gene, especially 50% of strains carry both nrps and pksI genes. Two strains with the best antimicrobial ability (S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 and S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1) were extracted bioactives using ethyl acetate. This extract inhibited 3 human pathogens (Bacillus cereus, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus) and was analyzed for antibacterial ingredients by GC-MS. Spectrum analysis of S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 extract obtained at least 6 active ingredients; including Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; 2,6 dihydroxybenzoic acid 3TMS; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; and Tetracosamethyl, cyclododecasiloxane. For S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 extract, obtained at least 7 major components: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Cyclododecane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene and Heptasiloxane, hexadecamethyl (in those, 2 compounds, namely Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl and Heptasiloxane, hexadecamethyl, were same as in S.albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 extract). These substances, particularly siloxanes, have been reported antimicrobial, antifungal and antioxidant. Bioactive ingredients of two actinobacteri strains retain their antibacterial properties after solvent treatment, opening up the possibility of application in the production of drugs and simultaneously serving as a basis for exploiting potential medicinal sources from mangrove soil actinobacteria, contributing to increase the effectiveness of treating human diseases. Thus, the species of actinobacteria along with bioactives present in Can Gio mangrove soil are similar to other mangrove areas in the world. Key words: actinobacteria, antibiotics, Can Gio mangrove, nrps gene, Streptomyces viii MỤC LỤC CHƯƠNG 1 ..................................................................................................................... 1 GIỚI THIỆU ................................................................................................................... 1 1. 1 Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 2 1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 2 1.5. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 3 1.6. Đóng góp mới của luận án ..................................................................................... 3 1.7. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án ............................................... 4 CHƯƠNG 2 ..................................................................................................................... 5 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................... 5 2.1 Sơ lược về rừng ngập mặn ...................................................................................... 5 2.1.1 Khái niệm và phân loại rừng ngập mặn ........................................................... 5 2.1.2. Rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh ........................................ 5 2.2. Vi sinh vật trong đất rừng ngập mặn ..................................................................... 7 2.3. Vi khuẩn sợi ........................................................................................................... 8 2.3.1 Giới thiệu về thuật ngữ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) .............................................. 8 2.3.2 Phân bố của vi khuẩn sợi trong tự nhiên .......................................................... 9 2.3.3. Đặc điểm sinh học tổng quát của vi khuẩn sợi................................................ 9 2.3.4 Phân loại (Taxonomy) vi khuẩn sợi ............................................................... 13 2.3.5. Những ứng dụng công nghệ sinh học của vi khuẩn sợi ................................ 18 2.4. Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp .................................................................. 19 2.4.1 Lược khảo chung về kháng sinh .................................................................... 19 2.4.2 Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp: ........................................................... 21 2.5. Sự tồn tại của các gen chỉ thị kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps) để nhận diện vi khuẩn sợi có khả năng tổng hợp kháng sinh ......................................................................... 26 2.6. Một số thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh phân lập từ rừng ngập mặn ...................................................................................................................... 31 2.6.1 Trên thế giới ................................................................................................... 31 2.6.2. Nghiên cứu trong nước ................................................................................. 36 CHƯƠNG 3 ................................................................................................................... 37 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 37 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 37 3.2. Phương tiện nghiên cứu ....................................................................................... 37 ix 3.2.1 Nguyên vật liệu .............................................................................................. 37 3.2.2 Thiết bị - dụng cụ ........................................................................................... 39 3.2.3 Hóa chất – môi trường ................................................................................... 39 3.3 Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 41 3.3.1 Thu thập và xử lý mẫu ................................................................................... 41 3.3.2 Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn sợi .................................................................. 42 3.3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn .................................................................... 45 3.3.4. Nhận diện vi khuẩn sợi bằng phương pháp sinh học phân tử ....................... 46 3.3.5 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS.............................................. 49 3.3.6. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi khuẩn sợi tiềm năng được tuyển chọn ....................................................................................................... 53 CHƯƠNG 4 ................................................................................................................... 57 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................................... 57 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn sợi ............................................................................... 57 4.1.1 Số lượng, nguồn gốc vi khuẩn sợi phân lập được: ......................................... 57 4.1.2 Đặc điểm hình thái các dòng vi khuẩn sợi phân lập được ............................. 58 4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn .............................................................. 64 4.3 Kết quả định danh và cây phả hệ di truyền ........................................................... 68 4.3.1 Định danh các dòng vi khuẩn sợi kháng khuẩn mạnh ................................... 68 4.3.2 Hình thái của các chủng vi khuẩn sợi được chọn .......................................... 71 4.4 Sự hiện diện của các gen chỉ thị kháng sinh ......................................................... 79 4.5. Chất kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi được chọn .................................... 84 4.5.1 Chiết tách chất kháng khuẩn của 2 dòng vi khuẩn sợi ................................... 84 4.5.2 Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 .................................................................................. 88 4.5.3 Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 .................................................................................... 95 CHƯƠNG 5 ................................................................................................................. 107 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................................ 107 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 107 5.2 Đề xuất ................................................................................................................ 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 109 DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ .................................................................... 133 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 134 x DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Dữ liệu phân loại VKS .................................................................... 14 Bảng 2.2: Phân phối Loài và Chi của VKS theo Lớp, Bộ, Họ ........................ 15 Bảng 2.3: Những cặp mồi khuếch đại gen của VKS ....................................... 28 Bảng 3.1: Danh sách mẫu đất lấy tại huyện Cần Giờ ...................................... 38 Bảng 3.2: Thành phần môi trường SCA .......................................................... 39 Bảng 3.3: Thành phần môi trường LB ............................................................. 40 Bảng 3.4: Thành phần môi trường MHA ........................................................ 40 Bảng 3.5: Quy ước khả năng kháng khuẩn ...................................................... 46 Bảng 3.6: Thành phần hóa chất để PCR nhận diện VKS ................................ 48 Bảng 3.7: Thành phần hóa chất để PCR gen pksI............................................ 50 Bảng 3.8: Thành phần hóa chất để PCR gen pksII .......................................... 51 Bảng 3.9: Thành phần hóa chất để PCR gen nrps ........................................... 52 Bảng 3.10: Chương trình nhiệt độ phân tích GC-MS ...................................... 56 Bảng 4.1: Nguồn gốc và số khuẩn lạc VKS phân lập được............................. 57 Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc VKS phân lập được ......................... 60 Bảng 4.3: Khả năng kháng khuẩn của các dòng VKS ..................................... 65 Bảng 4.4: Mức độ tương đồng gen (định danh) VKS với GenBank ............... 69 Bảng 4.5: Sự hiện diện các gen chỉ thị kháng sinh trong 8 dòng VKS ........... 80 Bảng 4.6: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ VKS S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1......................................................................................... 86 Bảng 4.7: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ VKS S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1......................................................................................... 86 Bảng 4.8: Các chất trong phổ GCMS cao chiết của VKS S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1......................................................................................... 88 Bảng 4.9: Các chất kháng khuẩn của VKS S.albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 ............................................................................................................................................... 91 Bảng 4.10: Thành phần chất kháng khuẩn tiêu biểu của VKS S. albogriseolus ANTHOIDONG