Luận án Sử dụng chế phẩm Protease trong xử lý cám gạo dùng cho chế biến thức uống dinh dưỡng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ HOÀNG PHƯỢNG SỬ DỤNG CHẾ PHẨM PROTEASE TRONG XỬ LÝ CÁM GẠO DÙNG CHO CHẾ BIẾN THỨC UỐNG DINH DƯỠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ SỐ: 62.54.01.01 NĂM 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ HOÀNG PHƯỢNG MÃ SỐ NCS: P1115003 SỬ DỤNG CHẾ PHẨM PROTEASE TRONG XỬ LÝ CÁM GẠO DÙNG CHO CHẾ BIẾN THỨC UỐNG DINH DƯỠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ SỐ: 62.54.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS.TS. LÝ NGUYỄN BÌNH NĂM 2023 i LỜI CẢM ƠN Mỗi thành quả lao động không chỉ đơn giản là nỗ lực của bản thân mà còn là sự đóng góp của nhiều người. Tôi đã may mắn nhận được sự giúp đỡ, đồng hành của nhiều cá nhân và tổ chức. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất. Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS,TS Lý Nguyễn Bình là người thầy đã hướng dẫn, hỗ trợ tôi xuyên suốt quá trình học tập và nghiên cứu sau đại học. Thầy không những truyền thụ kiến thức chuyên môn, thầy còn là người thầy vô cùng đáng kính trong hoạt động khoa học và trong cuộc sống. Được học tập thầy là sự may mắn và vinh dự cho tôi. Xin cảm ơn thầy đã luôn bao dung và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Bên cạnh đó, tôi còn nhận được sự quan tâm của nhiều thầy, cô tại Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Khoa Sau đại học Trường Đại học Cần Thơ. Quý thầy cô, anh chị em đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong học tập và nghiên cứu. Trong đó, tôi xin dành lời cảm ơn đến PGS,TS Trần Thanh Trúc. Nhờ có sự động viên, hỗ trợ của cô trong những lúc khó khăn, tôi đã vượt qua trở ngại và có được ngày hôm nay. Xin chân thành cảm ơn cô. Ngoài ra, tôi đã được cộng tác cùng các bạn sinh viên ngành Công nghệ Thực phẩm, học viên cao học Hồng Diệp Thanh Nghị đã góp phần làm cho kết quả luận án thêm phong phú và chuyên sâu. Xin cảm ơn các bạn rất nhiều. Và, đồng hành trong suốt thời gian qua, các anh chị em đồng nghiệp, quý lãnh đạo của Trường Đại học Kiên Giang đã chia sẻ, gánh vác công việc và luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành chương trình học. Tôi xin cảm ơn và tri ân tất cả sự giúp đỡ quý bàu này. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến đại gia đình. Nơi cho tôi động lực, cho tôi niềm tin để tôi tiếp tục phấn đấu đạt được mục tiêu của mình. Đặc biệt cảm ơn anh Trần Hữu Phúc luôn đồng hành, ủng hộ tinh thần và tài chính cho tôi. Cảm ơn hai con Trần Duy Quỳnh và Trần Vũ Phong luôn ngoan ngoãn để mẹ yên tâm học tập. Một lần nữa, tôi xin cảm ơn tất cả sự giúp đỡ của cá nhân, đơn vị đã dành cho tôi trong thời gian qua. Xin kính chúc quý thầy cô, anh chị em nhiều sức khỏe, bình an và hạnh phúc. Cần Thơ, ngày tháng năm 2023 Tác giả thực hiện Lê Hoàng Phượng ii TÓM TẮT Cám gạo là một nguồn phụ phẩm dồi dào và chứa hàm lượng dinh dưỡng cao. Trong nghiên cứu này hai chế phẩm protease thương mại được sử dụng để vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng 0,4% Flavourzyme hay 0,4% Protamex, lipase bị vô hoạt ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 4 hay 5 giờ, tương ứng. Lipase cũng được vô hoạt khi kết hợp Flavourzyme và Protamex với tỷ lệ enzyme sử dụng là 0,4% cho mỗi loại, xử lý ở nhiệt độ 50oC và đặc biệt thời gian vô hoạt rút ngắn còn 2 giờ. Sau khi vô hoạt lipase, dịch cám gạo được xử lý nhiệt (tiệt trùng), theo dõi sự thay đổi của thành phần các hợp chất bay hơi trong thời gian bảo quản. Bên cạnh đó, chất xơ prebiotic là fructooligosaccharides (FOS) được xác định có mặt trong cám gạo và chịu ảnh hưởng của các điều kiện chế biến. Kết quả xác định độ bền nhiệt của FOS trong điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau cho thấy sự phân hủy của FOS (bao gồm 1-kestose (GF2), nystose (GF3) và 1-fructosyl-nystose (GF4)) trích ly từ cám gạo theo thời gian xử lý nhiệt ở các giá trị pH 5,0, 6,0 và 7,0 tuân theo mô hình động học bậc một. Các giá trị hằng số tốc độ phân hủy nhiệt (k) của GF2, GF3 và GF4 tăng khi nhiệt độ xử lý tăng. Hằng số tốc độ phân hủy k của GF2, GF3 và GF4 có giá càng nhỏ khi pH của mẫu cám gạo có giá trị càng lớn trong khoảng từ 5,0 đến 7,0. FOS của cám gạo rất bền nhiệt ở vùng pH trung tính, trong khi nhạy cảm ở vùng pH acid. Sự phụ thuộc nhiệt độ của các hằng số tốc độ phân hủy nhiệt k của GF2, GF3 và GF4 trong khoảng nhiệt độ khảo sát có thể được mô tả đầy đủ bằng phương trình Arrhenius. Năng lượng hoạt hóa (Ea) trong khoảng pH từ 5,0 đến 7,0 tương ứng với GF2 tăng từ 61,80 đến 77,67 kJ/mol, GF3 từ 67,46 đến 92,31 kJ/mol và GF4 từ 49,24 đến 72,06 kJ/mol. Cám gạo sau khi vô hoạt lipase bằng Flavourzyme và Protamex được sử dụng chế biến sữa chua và bột dinh dưỡng. Chất lượng cảm quan của các sản phẩm được đánh giá ở mức tốt và thời gian bảo quản của bột dinh dưỡng là 2 tháng. Kết quả ban đầu này là nguồn dẫn liệu khoa học có giá trị về định hướng phát triển và khai thác nguồn phụ phẩm nông nghiệp trong tương lai. Từ khóa: cám gạo, fructooligosaccharides, hợp chất bay hơi, lipase, protease iii ABSTRACT Rice bran is the main by-product of rice milling processing and contains high quantities of valuable nutrients and bioactive compounds significantly related to human health. In the study, protease preparations were applied to inactivate lipase enzymes in rice bran. The results showed that when using 0.4% Flavorzyme or 0.4% Protamex, lipase was inactivated at 50oC for 4 and 5 hours, respectively. Lipase was also inactivated by a combination of Flavorzyme and Protamex at a level of 0.4% each for 2 hours. After lipase inactivation, the rice bran extract was thermally treated at different temperatures and the changes in volatile compounds were monitored during storage. Besides, the prebiotic fiber, fructooligosaccharides (FOS), was identified in rice bran that was influenced by processing conditions. The results of determining the thermal stability of FOS at different pH and temperature conditions showed that the decomposition of FOS (including 1-kestose (GF2), nystose (GF3) and 1-fructosyl-nystose (GF4)) according to heat treatment time at pH 5.0, 6.0, and 7.0 was followed a first-order kinetic model; rate constant (k) values for the thermal decomposition of GF2, GF3 and GF4 were increased with increasing treatment temperature. Analytical data also showed that GF2, GF3 and GF4 were very heat stable. In addition, these k values gradually decrease as the pH of the sample increases from 5.0 to 7.0. Furthermore, the dependence of temperature on the rate constant (k) values for the thermal decomposition of GF2, GF3 and GF4 in the investigated temperature range could be fully described by the Arrhenius equation. The activation energy (Ea) of GF2 in the pH range from 5.0 to 7.0 were from 61.80 to 77.67 kJ/mol, the case of GF3 from 67.46 to 92.31 kJ/mol, and in the case of GF4 from 49.24 to 72.06 kJ/mol, respectively. In the final study, the treated rice bran was used to make yoghurt and nutritional powder with good sensory quality (yoghurt) and the shelf life (nutritional powder). These were very positive initial results that contributed to the scientific databases on the nutritional composition and application of rice bran by- products as well as providing data for the development orientation and exploitation of agricultural by-products in the future. Keywords: fructooligosaccharides, lipase, protease, rice bran, volatile compound v MỤC LỤC 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu chung ........................................................................................................................2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể ........................................................................................................................2 1.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................................... 2 1.4 Ý nghĩa của luận án ...................................................................................................... 3 1.5 Điểm mới của luận án ................................................................................................... 3 2.1 Tổng quan về cám gạo và sự hư hỏng của cám gạo ....................................................... 4 2.1.1 Giới thiệu chung ......................................................................................................................4 2.1.2 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của cám gạo ...................................................................5 2.1.3 Một số ứng dụng của cám gạo .................................................................................................7 2.2 Tổng quan về hợp chất fructooligosaccharides.............................................................. 8 2.2.1 Cấu tạo của FOS ......................................................................................................................8 2.2.2 Tính chất của FOS ...................................................................................................................9 2.2.3 Ứng dụng của FOS ................................................................................................................10 2.3 Tổng quan về enzyme protease và cơ chế thủy phân ................................................... 11 2.3.1 Cấu tạo và phân loại enzyme protease...................................................................................12 2.3.2 Cơ chế thủy phân bằng enzyme .............................................................................................14 2.3.3 Ứng dụng của enzyme protease trong thực phẩm .................................................................16 2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằng enzyme ...............................................19 2.4 Hợp chất bay hơi và phương pháp xác định ................................................................ 20 2.4.1 Sự hình thành hợp chất bay hơi .............................................................................................20 2.4.2 Phương pháp xác định hợp chất bay hơi ...............................................................................25 2.5 Phương pháp Metabolomics trong nghiên cứu thực phẩm ........................................... 26 2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................................. 28 2.6.1 Nghiên cứu trong nước liên quan ..........................................................................................28 2.6.2 Nghiên cứu ngoài nước liên quan ..........................................................................................29 3.1 Phương tiện nghiên cứu .............................................................................................. 33 3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..........................................................................................33 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị ....................................................................................................................33 3.1.3 Hóa chất .................................................................................................................................33 vi 3.1.4 Nguyên liệu cám gạo .............................................................................................................35 3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 35 3.2.1 Các phương pháp phân tích cơ bản .......................................................................................35 3.2.2 Phương pháp xử lý số liệu .....................................................................................................36 3.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................................. 36 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo bằng enzyme protease thương mại (Protamex và Flavourzyme) ............................38 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ tiệt trùng và thời gian bảo quản lên thành phần hợp chất bay hơi của nước cám gạo .......................................................................................43 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu động học phân hủy nhiệt của hợp chất FOS (bao gồm GF2, GF3 và GF4) trích ly từ cám gạo ..................................................................................................................48 3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu sử dụng cám gạo đã vô hoạt enzyme lipase để chế biến thức uống dinh dưỡng.......................................................................................................................................50 4.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo bằng các chế phẩm Protamex và Flavourzyme thương mại ............................................ 55 4.1.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu cám gạo ......................................................................55 4.1.2 Ảnh hưởng của điều kiện trích ly enzyme lipase đến khả năng thu nhận enzyme này từ cám gạo ...............................................................................................................................................56 4.1.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo bằng chế phẩm Protamex và Flavourzyme .....................................................................................................65 4.1.4 Tác dụng phối hợp của chế phẩm Protamex và Flavourzyme đến khả năng vô hoạt enzyme lipase trong cám gạo ........................................................................................................................72 4.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng của các chế độ tiệt trùng và thời gian bảo quản lên thành phần hợp chất bay hơi của nước cám gạo ...................................................................................... 77 4.2.1 Kết quả khảo sát chương trình chạy nhiệt thích hợp trong nghiên cứu hợp chất bay hơi có trong nước cám gạo thủy phân ........................................................................................................77 4.2.2 Ảnh hưởng của chế độ tiệt trùng lên hợp chất bay hơi trong dịch thủy phân cám gạo .........80 4.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa bổ sung, nhiệt độ và thời gian cân bằng trong lấy mẫu headspace tĩnh ....................................................................................................................82 4.2.4 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên thành phần hợp chất bay hơi trong nước cám gạo tiệt trùng ...............................................................................................................................................87 4.3 Nội dung 3: Động học phân hủy nhiệt của các hợp chất GF2, GF3 và GF4 trích ly từ cám gạo ................................................................................................................................... 90 4.3.1 Xây dựng các đường chuẩn làm cơ sở định lượng GF2, GF3 và GF4 trong cám gạo ............90 4.3.2 Động học phân hủy nhiệt ở các giá trị pH khác nhau của các hợp chất GF2, GF3 và GF4 trích ly từ cám gạo ...................................................................................................................................95 4.3.3 Mô hình hóa sự phụ thuộc nhiệt độ và pH kết hợp của các hằng số tốc độ phân hủy của hợp chất GF2, GF3 và GF4 trích ly từ cám gạo .....................................................................................101 4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu chế biến sản phẩm ứng dụng từ cám gạo đã xử lý enzyme lipase ................................................................................................................................. 105 4.4.1 Ứng dụng chế biến sữa chua uống bổ sung dịch cám gạo đã vô hoạt enzyme lipase .........106 4.4.2 Ứng dụng bã cám gạo đã xử lý enzyme lipase trong chế biến bột uống dinh dưỡng..........112 vii 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 117 5.2 Kiến nghị ................................................................................................................. 118 1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase ............................................................................1 2 Xác định hàm lượng glycerol bằng phương pháp quang phổ .......................................................2 3 Phương pháp trích ly và xác định fructooligosaccharide (FOS) [1-kestose (GF2), nystose (GF3), và 1-fructosyl-nystose (GF4)] từ cám gạo.........................................................................................3 viii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 So sánh thành phần hóa học của cám gạo và cám một số loại ngũ cốc khác ............. 5 Bảng 2.2 So sánh thành phần acid amin (g/16gN) của cám gạo và ngũ cốc khác .................... 6 Bảng 2.3 Số lượng các hợp chất dễ bay hơi thuộc các lớp hóa học khác nhau được báo cáo trong cám gạo (Nguồn: Henk, 1991) ............................................................................................. 23 Bảng 2.4 Chất bay hơi trong gạo nấu truyền thống (Nguồn: Henk, 1991) ............................. 24 Bảng 2.5 Các chất bay hơi hình thành do tự oxy hóa các acid béo không no (Nguồn: Henk, 1991) ............................................................................................................................ 24 Bảng 2.6 Số lượng đỉnh phổ biến nhận được trong các chất chuyển hóa thực phẩm .............. 28 Bảng 3.1 Một số phương pháp phân tích các tính chất hóa lý cơ bản .................................... 35 Bảng 3.2 Ba nhân tố dùng trong phương pháp bề mặt đáp ứng với thiết kế Box-Behnken .... 40 Bảng 3.3 Ma trận thực nghiệm thí nghiệm tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaCl, tỉ lệ dung dịch trích ly/nguyên liệu và thời gian trích ly đến hoạt tính lipase ................................................ 40 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp vô hoạt lipase trong cám gạo ........... 41 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ enzyme sử dụng và thời gian vô hoạt đối với lipase trong cám gạo ...................................................................................................................... 42 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme và thời gian đến khả năng vô hoạt enzyme lipase ........................................................................................... 42 Bảng 3.7 Các nhân tố ảnh hưởng trong lấy mẫu headspace tĩnh ............................................ 45 Bảng 3.8 Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ dung dịch NaCl bão hòa (so với dung dịch mẫu, V/V), nhiệt độ và thời gian cân bằng trong lấy mẫu headspace tĩnh ...................................... 45 Bảng 3.9 Công thức pha dung dịch đệm photphat-citrat theo TCVN 4320:1986 ứng với các giá trị pH tại 5,0, 6,0 và 7,0........................................................................................................ 49 Bảng 3.10 Chương trình pha động A và B chạy sắc ký và điều kiện phân mảnh để phân tích khối phổ định lượng GF2, GF3 và GF4. ................................................................................. 50 Bảng 3.11 Tỷ lệ phối trộn nguyên liệu tạo bột uống hỗn hợp cám gạo dinh dưỡng vị cacao .. 53 Bảng 4.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu cám gạo. ...................................................... 55 Bảng 4.2 Hoạt tính lipase thu nh