Luận án Tính kháng thuốc Oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam 2001-2012

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -----------------*------------------- HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2014 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG -----------------*------------------- HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG TÍNH KHÁNG THUỐC OSELTAMIVIR CỦA VIRUT CÚM A LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2001 – 2012 Chuyên ngành: Vi sinh Y học Mã số : 62.72.01.15 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Đặng Đức Anh 2. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai HÀ NỘI – 2014 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. NGHIÊN CỨU SINH Hoàng Vũ Mai Phương iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:  Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.  Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương. Đã tạo điều khiện tốt nhất, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến GS.TS Đặng Đức Anh, người đã tạo điều kiện cho tôi đến với chuyên ngành vi rút, cho tôi những lời khuyên hữu ích, sự động viên và lòng nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, người đã tận tình dìu dắt giúp đỡ tôi từ những ngày đầu tiên bước chân vào lĩnh vực vi rút học, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và luôn khuyến khích tôi bước về phía trước, tiếp cận với những kiến thức nâng cao và mở rộng để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Ths Nguyễn Cơ Thạch, Ths Lê Thị Thanh, CN Phạm Thị Hiền cùng các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng thí nghiệm Cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của Trung tâm Cúm thuộc Viện sức khỏe Hàn Quốc (KNIH )trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mendi Jamsran, TS Aeron Hurt, chuyên viên của Tổ chức Y tế Thế giới, cho những hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu. Tôi xin gửi tặng Gia đình, bạn bè và những người thân trong gia đình đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành quả ngày hôm nay. Hà nội, ngày 22 tháng 10 năm 2013 HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG v MỤC LỤC Trang phụ bìa .................................................................................................... i Lời cam đoan ..................................................................................................... ii Lời cảm ơn......................................................................................................... iii Mục lục .............................................................................................................. iv Chữ viết tắt ........................................................................................................ vii Danh mục bảng ................................................................................................. viii Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ ......................................................................... ix ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN ............................................................................ 4 1.1. Vi rút cúm A ............................................................................................... 4 1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A ................................................. 4 1.1.2. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm A .............................................................. 11 1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A ...................... 13 1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A ............................... 15 1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm ............................................................. 16 1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A ......................................................................... 17 1.2. Phòng và điều trị cúm A ............................................................................ 18 1.2.1. Văc xin phòng cúm ................................................................................... 18 1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A ....................................................................... 20 1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới ....................................................................... 23 1.3. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút ............ 25 1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine ..................... 25 1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir...................... 26 1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A ...... 27 vi 1.4.1. Nguyên nhân của hiện tượng kháng thuốc ................................................. 27 1.4.2. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm ........................................................... 28 1.4.3. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của neuraminidase ..................................................................................................... 32 1.4.4. Giám sát sự kháng thuốc vi rút cúm........................................................... 34 CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 37 2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 37 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 37 2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm ................................................................. 38 2.3.1. Vật liệu ..................................................................................................... 38 2.3.2. Kỹ thuật xét nghiệm .................................................................................. 42 2.4. Phân tích số liệu.......................................................................................... 51 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ ............................................................................... 53 3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 – 2012 ............................ 53 3.2. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A .......................... 54 3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A ....................................... 60 3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng cúm A liên quan đến kháng thuốc oseltamivir .............................................................................................. 65 3.5. Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012 .......................................................................................................... 69 3.6. Sự tương đồng về gen HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ nhạy oseltamivir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn nghiên cứu .......................................................................................................... 72 vii CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN............................................................................. 86 4.1. Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu .......... 86 4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50) ............................................................................... 88 4.3. Sự liên quan của các đột biến trên gen NAvới quá trình kháng thuốc oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam ..................... 94 4.4. Sự liên quan về mặt di truyền học của các chủng vi rút A mang gen đột biến và các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian. ...................................................... 98 KẾT LUẬN ....................................................................................................... 101 KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems APHL Association of Public Health Laboratories (Tổ chức của các PTN trong hệ thống Y tế Cộng đồng) ATSH An Toàn Sinh Học DNA Deoxiribonucleic Acid GISRS Global Influenza Surveillance and Response System (Hệ thống phản ứng và giám sát cúm toàn cầu) IC50 Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50% vi rút) IQR Interquartile Range (Khoảng liên tứ phân vị) ISIRV-AVG International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases – Antiviral Group (Hiệp hội quốc tế về cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác – Nhóm nghiên cứu thuốc kháng vi rút) Kb Kilobase NAI Neuraminidase Inhibition (Ức chế neuraminidase) NIID National Institute of Infectious Diseases - Japan (Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia – Nhật Bản) PCR Polymerase Chain Reaction pdm Pandemic PTN Phòng Thí Nghiệm RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction SOP Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới US-CDC United States- Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) ix DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A ............................................................ 6 3.1. Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu .........53 3.2. Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn ................................ 56 3.3. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009 .............................................................................................................60 3.4. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm 2009 và 2011 ................................................................................................61 3.5. Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 ...........................62 3.6. Giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 ................................62 3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với oseltamivir................................................................................................64 3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm đột biến ........................................................................................................70 3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen) ..........71 x DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ Hình Tên hình Trang 1.1. Cấu trúc vi rút cúm ....................................................................................... 4 1.2. Hình ảnh vi rút cúm ...................................................................................... 4 1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm ...........10 1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm ....................................................10 1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút ...........12 1.6. Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine ........................21 1.7. Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir ..........................................................22 1.8. Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào .............................................23 2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen ................................................50 3.1. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1 .............66 3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1pdm09 .............................................................................................67 3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 ..............68 3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 ..............69 3.5. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 ..............................74 3.6. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 – nhóm 2, 2001-2009 .......................................................................................75 3.7. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 ..............................76 3.8. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm 2, 2001-2009 ................................................................................................77 3.9. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................79 3.10. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09 ................................80 3.11. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 .................................................83 xi 3.12. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 1 ................................84 3.13. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 2.3.4 ...............................84 Sơ đồ Tên sơ đồ Trang 2.1. Quá trình phân lập vi rút cúm ................................................................ 43 2.2. Quá trình xác định giá trị ức chế 50% của oseltamivir với vi rút cúm ..........45 Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1. Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 .................55 3.2. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên cứu ............................................................................................................... 57 3.3. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu ................................................................................................ 58 3.4. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên cứu ...............................................................................................................58 3.5. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng H5N1 trong nghiên cứu ............................................................................................................... 59 4.1. Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 – 2012 ........................................86 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI vẫn đang là một thách thức lớn với các nhà khoa học trong ngành y học dự phòng ở Việt Nam. Nếu như trước đây, bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủ yếu từ vi khuẩn thì hiện nay căn nguyên vi rút lại là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch nguy hiểm, đe dọa tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người. Các vụ dịch điển hình xảy ra gần đây như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Bệnh cúm tại Việt Nam, theo thống kê của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong quá trình giám sát các ca nhiễm cúm phối hợp với trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC), số người mắc cúm có xu hướng tăng lên từ 19,1% năm 2007, lên 21% năm 2008, 26,1% năm 2009 (Hệ thống giám sát cúm Quốc gia-NISS), đặc biệt đã có những trường hợp tử vong do nhiễm cúm gia cầm có độc lực cao. Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Tuy nhiên, văc xin cúm đang lưu hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm. Hơn nữa, muốn đạt hiệu quả cao, chủng cúm trong thành phần văc xin phải có sự tương đồng kháng nguyên với chủng cúm lưu hành. Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch khi tiêm văc xin cúm còn phụ thuộc vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin sử dụng (văc xin cúm bất hoạt truyền thống, văc xin cúm bán phần (split vaccine)). Do vậy, hiện tại sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine, oseltamivir...) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút cúm, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1. Tuy nhiên, sự tương tác của thuốc với vi rút có thể gây ra thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút mà một trong những hệ quả là xuất hiện vi rút kháng thuốc ở thế hệ sau. Hiện tượng kháng thuốc có thể ảnh hưởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân: thời gian điều trị kéo dài, khả năng hồi phục sau điều trị chậm và tăng khả năng lây truyền chủng vi rút cúm kháng thuốc ra cộng đồng, làm tăng thêm gánh nặng bệnh tật cho bản thân bệnh nhân và xã hội [28, 81, 90, 121]. Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc, mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan 2 truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Đặc tính kháng thuốc cũng như mức độ tiến hoá của vi rút đã được tiến hành tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN) trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan.... Các nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện, giám sát và theo dõi các trường hợp kháng thuốc đơn lẻ hoặc theo nhóm, tìm hiểu các đột biến trên gen có liên quan đến khả năng kháng thuốc của vi rút cúm trên người và trên gia cầm [8,11,12,26,51]. Số liệu từ các nước Châu Âu, Úc, Mỹ và các nước khu vực Đông Nam Á cho thấy vi rút A/H1N1 lưu hành trước năm 2007 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), từ 2007 đến 2009 tỉ lệ kháng tăng dần (23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm 2009) [27, 66, 110]; các vi rút A/H3N2 được xác định kháng hoàn toàn (100%) với amantadine. Tại Việt Nam, quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại học Oxford thuộc bệnh viện Bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh [18,36,37]. Tại phòng thí nghiệm Cúm - viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, những trường hợp nhiễm vi rút cúm có mang gen kháng thuốc đơn lẻ đã được xác định từ những năm 2001 [56, 58, 60]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ hoàn thành ở mức độ ca bệnh riêng lẻ hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, chưa có nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá theo thời gian của chủng vi rút cúm A mang gen kháng thuốc. Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành, tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc của vi rút cúm A. Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu: - Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam. - Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50). 3 - Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012. 4 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1. Vi rút cúm A 1.1.1. Cấu tạo chun