Luận án Trích ly và thu nhận dịch chiết giàu polyphenol từ húng lũi (mentha aquatica linn.var.crispa) và thử nghiệm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ LÊ VĂN NHẤT HOÀI TRÍCH LY VÀ THU NHẬN DỊCH CHIẾT GIÀU POLYPHENOL TỪ HÚNG LŨI (Mentha aquatica Linn. var. crispa) VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 9.54.01.01 Cán bộ hướng dẫn 1 PGS.TS. Lê Trung Thiên Cán bộ hướng dẫn 2 PGS.TS Đàm Sao Mai Tp. Hồ Chí Minh, năm 2024 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Lê Trung Thiên và PGS.TS Đàm Sao Mai. Các kết quả nghiên cứu trong luận án này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kỳ nguồn nào dưới bất kỳ hình thức nào. Tác giả luận án Lê Văn Nhất Hoài iii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận án này tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ các tập thể lãnh đạo, các nhà khoa học, các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giảm hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập nghiên cứu tại trường. Xin gửi lời tri ân đến các thầy cô thuộc Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã hỗ trợ và giảng dạy các kiến thức quý báu giúp tôi hoàn thành luận án này. Đặc biệt tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Lê Trung Thiên và PGS.TS Đàm Sao Mai, những người đã truyền thụ cho tôi kiến thức, tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi giải quyết những khó khăn khi thực hiện luận án này. Xin gửi lời cảm ơn chân thành của tôi đến Ban giám hiệu trường Đại học Công nghiệp TP.HCM, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm, các đồng nghiệp, bạn bè và người thân trong gia đình đã giúp đỡ, chia sẽ kinh nghiệm và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin chân thành cảm ơn Nghiên cứu sinh Lê Văn Nhất Hoài iv TÓM TẮT Polyphenol là hợp chất có chứa một hay nhiều vòng thơm với một hoặc nhiều nhóm hydroxyl (-OH), chúng được tìm thấy ở tất cả các bộ phận của cây, là thành phần phổ biến trong nông sản. Polyphenol được biết đến là nhóm chất có hoạt tính sinh học cao như khả năng kháng oxy hóa, chống vi sinh vật, kháng viêm. Việc tách chiết polyphenol từ thực vật đã được nghiên cứu nhiều trong thời gian gần đây, tuy nhiên việc thực hiện trích ly polyphenol từ Húng lũi và thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thu được chưa được thực hiện. Húng lũi (Mentha aquatica Linn. var. crispa) được trồng nhiều ở Việt nam, tuy nhiên có một số thời điểm chúng không được thu hoạch do vấn đề giá cả và tiêu thụ. Các nghiên cứu về cây húng lũi ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào tách chiết tinh dầu, polyphenol nếu được tách chiết tiếp theo sau quá trình tách chiết tinh dầu và ứng dụng chúng vào bảo quản thực phẩm một mặt sẽ nâng cao giá trị kinh tế của cây húng lũi, mặt khác có thể cung cấp thêm một giải pháp bảo quản thực phẩm tự nhiên và an toàn. Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện với 3 nội dung chính. Nội dung 1. Trích ly polyphenol từ húng lũi Báo cáo này đưa ra các phương pháp trích ly polyphenol từ húng lũi như phương pháp trích ly bằng ngâm chiết, phương pháp trích ly bằng ngâm chiết có hỗ trợ siêu âm và phương pháp trích ly bằng ngâm chiết có hỗ trợ enzym và tối ưu hóa theo mô hình Box – Behnken nhằm thu được dịch chiết có tổng polyphenol thu được (TPC) và hoạt tính kháng oxy hóa (AA) của dịch chiết cao nhất. Kết quả cho thấy dung môi acetone với nồng độ 50%, tỉ lệ 1:20, thời gian 2h và nhiệt độ 40oC cho hiệu quả trích ly tốt nhất. Nội dung 2. Sản xuất chế phẩm và đánh giá hoạt tính sinh học Quá trình sản xuất cao chiết từ húng lũi được thực hiện bằng phương pháp ngâm chiết với các dung môi acetone với nồng độ 50%, tỉ lệ 1:20, thời gian 2h và nhiệt độ 40oC. Xác định TPC, hoạt tính kháng oxy hóa theo DPPH, ABTS và FRAP, và khả năng kháng khuẩn theo phương pháp MIC trên 4 chủng vi khuẩn E. coli – ATCC 25922, S. enteritidis – ATCC 13076, S. aureus– ATCC 25923, và B. subtilis – ATCC 25924. Kết v quả thu được TPC là 247.25±0,71mg GAE/g ck, khả năng kháng oxy hóa theo DPPH, ABTS và FRAP lần lượt là 419,59±0,52 µmol TE/g ck; 711,17±0,82 µmol TE/g ck và 1018,47±3,27 µmol Fe2+/g ck. Quá trình phân lập và xác định cấu trúc các thành phần trong cao chiết thu được kết quả là phân lập được 6 chất gồm cis-p-menth-3-ene-1,2,8- triol; trans-p-menth-3-ene-1,2,8-triol; p-mentha-3,8-dien-1-ol; p-coumaric acid; gallic acid; methyl--D galactopyranoside. Trong nghiên cứu quá trình vi bao bằng kỹ thuật sấy phun đã khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, loại chất mang và nồng độ chất mang đến hiệu suất thu hồi, TPC, AA và hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm vi bao polyphenol thu được bằng kỹ thuật sấy phun. Kết quả cho thấy nhiệt độ sấy phun là 150oC, nồng độ chất mang là 15% cho hiệu quả vi bao tốt nhất với cả chất mang gum arabic và malto-dextrin. Bên cạnh quá trình vi bao, dịch chiết cũng có thể ứng dụng để tổng hợp nano bạc. Với nghiên cứu tổng hợp nano bạc, đã xác định được nồng độ AgNO3 tốt nhất để tạo nano là 1 mM, thời gian khuấy là 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Hạt nano thu được có kích thước trung bình là 83,6 nm, phổ FTIR cho thấy các nhóm chất như rượu, phenol, ankyl halogenua và ankyn có thể đóng vai trò khử và ổn định cho nano bạc. Nội dung 3. Ứng dụng chế phẩm vào bảo quản thực phẩm Ứng dụng cao chiết và sản phẩm sấy phun để bảo quản cá basa lạnh đông và lạnh thường, các chỉ số của cá basa được theo dõi bao gồm pH, PV, TBARS, APC. Kết quả cho thấy các mẫu sử dụng cao chiết và sản phẩm sấy phun đều có hiệu quả cao hơn so với mẫu đối chứng âm. Các kết quả nghiên cứu cho thấy việc khai thác polyphenol từ húng lũi, tạo chế phẩm và ứng dụng vào thực phẩm hoàn toàn khả thi, nó giúp cung cấp thêm một giải pháp bảo quản thực phẩm an toàn đồng thời nâng cao giá trị của cây húng lũi. vi ABSTRACT Polyphenols are compounds containing one or more aromatic rings with one or more hydroxyl groups (-OH), they are found in all parts of plants, and are common ingredients in agricultural products. Polyphenols are known compounds with high biological activities such as anti-oxidation, anti-microbial, anti-inflammatory properties.... Extraction of polyphenols from plants has been researched a lot recently, however, Extraction of polyphenols from Mentha aqutica Linn. var. crispa and testing biological activity of the extract has not been done. Mentha aquatica Linn. var. crispa is widely grown in Vietnam, but sometimes it is not harvested because of price and consumption issues. In Vietnam, research on Mentha aquatica L. mainly focuses on essential oil extraction, if polyphenols are extracted next to the essential oil extraction process and applied to food preservation, it not only increase the economic value of the Mentha aquatica L. but also, it can provide a solution to preserve food natural and safety. In this study we work with 3 main contents. 1. Extraction of polyphenols from Mentha aqutica Linn. var. crispa This study establishes methods for extracting polyphenols from Mentha aqutica L. such as maceration extraction, ultrasound-assisted maceration extraction and enzym- assisted maceration extraction method. Optimized extraction according to the Box - Behnken model to obtain the extract with the highest total polyphenols (TPC) and antioxidant activity (AA) of the extract. The results have shown that acetone at a concentration of 50%, at a ratio of 1:20 (w/v), extraction time of 2 h and a temperature of 40 °C give the highest values of TPC and AA. 2. Manufacturing of preparations and evaluation of biological activity Manufacturing of extracts from Mentha aquatica L. is carried out by maceration extraction method with acetone at a concentration of 50%, at a ratio of 1:20 (w/v), extraction time of 2 h and a temperature of 40 °C. Determination of TPC, antioxidant activity according to DPPH, ABTS and FRAP, and antibacterial ability according to vii MIC method on 4 bacterial strains E. coli – ATCC 25922, S. enteritidis – ATCC 13076, S. aureus – ATCC 25923 , and B. subtilis – ATCC 25924. The results obtained were TPC of 247.25±0.71mg GAE/g dw, AA according to DPPH, ABTS and FRAP respectively was 419.59±0.52 µmol TE/g dw; 711.17±0.82 µmol TE/g dw and 1018.47±3.27 µmol Fe2+/g dw. The process of isolating and determining the structure of the compounds in the extract has isolated 6 substances including: cis-p-menth-3- ene-1,2,8-triol; trans-p-menth-3-ene-1,2,8-triol; p-mentha-3,8-dien-1-ol; p-coumaric acid; gallic acid; methyl--D galactopyranoside. In the study of microencapsulation using spray drying technique, we investigated effects of temperature, carrier type and carrier concentration on EY, TPC, AA and antibacterial activity of obtained product. Results showed that spray drying at 150 °C and 15 % GA or MD concentration gave the best microencapsulation efficiency In research synthesis silver nanoparticles, the best concentration of AgNO3 to create nanoparticles has been determined to be 1 mM, stirring time of 24 hours at room temperature. The nanoparticles obtained have an average size of 83.6 nm. The FTIR spectra indicated that functional groups such as alcohols, phenols, alkyl halides, and alkynes could act as reducing and stabilising agents for AgNPs. 3. Application of preparations in food preservation Applying extracts and spray drying products to preserve frozen and cooling basa fish, Determined pH, PV, TBARS, APC during storage. The results showed that samples using extract and spray-dried products were more effective than the negative control sample. The results show that extraction polyphenols from Mentha aquatica L., manufacturing products and applying them to food preservation is completely feasible. It helps provide an additional safe food preservation solution and increase the value of Mentha aquatica L. viii MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ........................................................................................... 5 1.1 Polyphenol .............................................................................................................. 5 1.1.1 Khái niệm – phân loại polyphenol ..................................................................... 5 1.1.2 Hoạt tính sinh học của polyphenol ..................................................................... 7 1.1.2.1 Hoạt tính chống oxi hóa của polyphenol ..................................................... 8 1.1.2.2 Hoạt tính chống vi sinh vật .......................................................................... 8 1.1.2.3 Các hoạt tính khác ...................................................................................... 10 1.2 Trích ly polyphenol từ thực vật .......................................................................... 11 1.2.1 Khái niệm – phân loại ...................................................................................... 11 1.2.2 Các phương pháp trích ly ................................................................................. 12 1.2.2.1 Phương pháp trích ly truyền thống ............................................................. 12 1.2.2.2 Phương pháp hiện đại ................................................................................. 13 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly polyphenol ................................. 15 1.2.3.1 Ảnh hưởng của dung môi ........................................................................... 15 1.2.3.2 Ảnh hưởng của pH ..................................................................................... 16 1.2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................. 16 1.2.3.4 Ảnh hưởng của thời gian trích ly ............................................................... 17 1.2.3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi .............................................. 17 1.2.3.6 Ảnh hưởng của nguyên liệu ....................................................................... 18 1.3 Sản xuất chế phẩm vi bao polyphenol bằng kỹ thuật sấy phun ...................... 18 1.3.1 Khái niệm – Phân loại phương pháp vi bao ..................................................... 18 1.3.2 Công nghệ sấy phun tạo sản phẩm vi bao ........................................................ 19 1.3.3.1 Khái niệm sấy phun và ứng dụng sấy phun trong vi bao ........................... 19 1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vi bao bằng sấy phun ....................... 20 1.3.2.3 Một số hạn chế khi áp dụng sấy phun trong quá trình vi bao .................... 21 1.3.3 Các cơ chế giải phóng chất vi bao ................................................................... 22 ix 1.3.4 Ứng dụng của vi bao trong công nghệ thực phẩm ........................................... 23 1.4 Tổng hợp xanh nano Ag ...................................................................................... 23 1.4.1 Khái niệm – phân loại ...................................................................................... 23 1.4.2 Các phương pháp tạo nano ............................................................................... 24 1.4.3 Tổng hợp xanh nano Ag ................................................................................... 24 1.4.3.1 Tổng hợp nano với tác nhân khử từ Tảo .................................................... 24 1.4.4.2 Tổng hợp nano với tác nhân khử từ Nấm .................................................. 25 1.4.4.3 Tổng hợp nano với tác nhân khử từ Vi khuẩn ........................................... 25 1.4.4.4 Tổng hợp nano với tác nhân khử từ dịch chiết thực vật............................. 26 1.4.5 Đặc tính kháng khuẩn của nano Ag tổng hợp từ dịch chiết thực vật ............... 27 1.5 Húng lũi ................................................................................................................ 29 1.5.1 Các đặc tính thực vật và ứng dụng của cây húng lũi ....................................... 29 1.5.2 Các thành phần hoạt chất trong cây húng lũi ................................................... 31 1.5.2.1 Polyphenol.................................................................................................. 31 1.5.2.2 Tinh dầu ..................................................................................................... 32 1.5.3 Hoạt tính sinh học của cây húng lũi ................................................................. 33 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 35 2.1 Nguyên liệu ........................................................................................................... 35 2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 36 2.2.1 Nội dung 1. Trích ly polyphenol từ húng lũi ................................................... 37 2.2.1.1 Bố trí thí nghiệm trích ly theo phương pháp ngâm chiết ........................... 37 2.2.1.2 Bố trí thí nghiệm trích ly theo phương pháp có hỗ trợ siêu âm ................. 37 2.2.1.3 Bố trí thí nghiệm trích ly theo phương pháp có hỗ trợ enzym ................... 37 2.2.1.4 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa ....................................................................... 38 2.2.2. Nội dung 2. Sản xuất chế phẩm và đánh giá hoạt tính sinh học ..................... 39 2.2.2.1 Xác định hoạt tính sinh học và thành phần của cao chiết .......................... 39 2.2.2.2 Vi bao bằng kỹ thuật sấy phun ................................................................... 40 2.2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định hạn sử dụng (shelflife) của cao chiết và chế phẩm vi bao bằng sấy phun ...................................................................................................... 41 x 2.2.2.4 Bố trí thí nghiệm quá trình tổng hợp nano bạc .......................................... 41 2.2.3 Nội dung 3. Bước đầu ứng dụng các chế phẩm trong bảo quản thực phẩm .... 42 2.2.3.1 Ứng dụng cao chiết và sản phẩm sấy phun bảo quản cá basa đông lạnh ... 42 2.2.3.2 Ứng dụng cao chiết và sản phẩm sấy phun bảo quản lạnh cá basa ............ 44 2.3 Các phương pháp phân tích ............................................................................... 44 2.3.1 Xác định hàm lượng polyphenol tổng .............................................................. 44 2.3.2 Xác định khả năng kháng oxy hóa theo DPPH ................................................ 44 2.3.3 Xác định khả năng kháng oxy hóa theo ABTS ................................................ 45 2.3.4 Xác định khả năng kháng oxy hóa theo FRAP ................................................ 45 2.3.5 Xác định khả năng kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch ...... 45 2.3.6 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum inhibitory concentration) theo phương pháp pha loãng ..................................................................................... 46 2.3.7 Xác định chỉ số PV........................................................................................... 46 2.3.8 Xác định chỉ số TBARS ................................................................................... 46 2.3.9 Xác định tổng số vi sinh vật trong mẫu ........................................................... 47 2.3.10 Các phương pháp phân tích và đo đạc khác ................................................... 47 2.4 Xử lý số liệu .......................................................................................................... 48 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ....................................... 49 3.1 Nội dung 1. Trích ly polyphenol từ húng lũi ..................................................... 49 3.1.1 Trích ly bằng phương pháp ngâm chiết ........................................................... 49 3.1.1.1 Ảnh hưởng của loại dung môi .................................................................... 49 3.1.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ............................................................. 50 3.1.1.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi .................................................................... 52 3.1.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly ................................................................ 53 3.1.1.5 Ảnh hưởng của thời gian trích ly ............................................................... 54 3.1.2. Trích ly có hỗ trợ siêu âm ............................................................................... 55 3.1.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ............................................................ 55 3.1.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi .................................................................... 57 3.1.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly ................................................................ 58 xi 3.1.2.4 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến TPC và AA của dịch chiết ............ 59 3.1.3. Trích ly có hỗ trợ enzym ................................................................................. 61 3.1.3.1. Ảnh hưởng pH tiền xử lý enzym ............................................................... 61 3.1.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzym tiền xử lý ................................................. 62 3.1.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tiền xử lý enzym ................................................. 63 3.1.3.4 Ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý enzym ................................................ 64 3.1.4. Tối ưu hóa quá trình trích ly ........................................................................... 66 3.1