Luận án Tuyến trùng ký sinh gây hại trên cà rốt ở Việt Nam và thử nghiệm biện pháp sinh học trong phòng trừ chúng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ DUYÊN TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY HẠI TRÊN CÀ RỐT Ở VIỆT NAM VÀ THỬ NGHIỆM BIỆN PHÁP SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ CHÚNG Chuyên ngành: Tuyến trùng học Mã số: Thí điểm LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ DUYÊN TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY HẠI TRÊN CÀ RỐT Ở VIỆT NAM VÀ THỬ NGHIỆM BIỆN PHÁP SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ CHÚNG Chuyên ngành: Tuyến trùng học Mã số: Thí điểm LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Nguyễn Ngọc Châu 2. TS. Trịnh Quang Pháp Hà Nội – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án “TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY HẠI TRÊN CÀ RỐT Ở VIỆT NAM VÀ THỬ NGHIỆM BIỆN PHÁP SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ CHÚNG” là công trình nghiên cứu do bản thân tôi thực hiện. Các trích dẫn tham khảo trong Luận án theo các nguồn công bố đầy đủ, rõ ràng. Số liệu, kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa từng công bố hoặc đã công bố trong các bài báo khoa học mà tác giả là tác giả hoặc đồng tác giả. Tác giả luận án NCS. Nguyễn Thị Duyên ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới PGS.TS. Nguyễn Ngọc Châu và TS. Trịnh Quang Pháp đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn TS. Vũ Thị Thanh Tâm, TS. Nguyễn Thị Ánh Dương, ThS. Lê Thị Mai Linh, ThS. Nguyễn Hữu Tiền - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, PGS.TS. Nguyễn Phương Nhuệ - Viện Công nghệ sinh học và TS. Phạm Thị Hòa - Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng đã hỗ trợ tôi trong quá trình hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, phòng Tuyến trùng học, phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, Học viện Khoa học và Công nghệ cùng các đồng nghiệp, thầy cô trong Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR) trong đề tài mã số: IEBR.ĐT/04/16-17 và Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia trong đề tài mã số: 106.12-2012.84 đã hỗ trợ kinh phí để tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, Ngày 8 tháng 1 năm 2019 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Duyên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... ii DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................ vi DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................... viii MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN ................................................................................................ 7 1.1.Cây cà rốt .................................................................................................................... 7 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, giá trị và đặc điểm sinh trưởng phát triển ................... 7 1.1.2. Tình hình sản xuất cà rốt trên thế giới ............................................................... 8 1.1.3. Tình hình sản xuất cà rốt ở Việt Nam ................................................................ 8 1.2. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng ký sinh gây hại cà rốt trên thế giới ............... 9 1.2.1. Các nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng trên cà rốt ....................................... 9 1.2.2. Phân loại hình thái và phân tử tuyến trùng thực vật ...................................... 13 1.2.3. Khả năng phòng trừ sinh học tuyến trùng thực vật bằng nấm đối kháng ...... 17 1.3. Tình hình nghiên cứu tuyến trùng thực vật ở Việt Nam ..................................... 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 26 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................... 26 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 26 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 26 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 27 2.2.1. Phương pháp điều tra, thu mẫu tuyến trùng .................................................... 27 2.2.2. Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất và mô thực vật................................ 27 2.2.3. Phương pháp nhân nuôi tuyến trùng Meloidogyne spp. và Pratylenchus spp. ... 28 2.2.4. Phương pháp xử lý, làm trong và làm tiêu bản tuyến trùng ............................ 29 2.2.5. Phương pháp chuẩn bị mẫu chụp ảnh KHV điện tử quét ............................... 30 2.2.6. Các chỉ số đo hình thái trong phân loại tuyến trùng ....................................... 30 2.2.7. Phương pháp phân tích phân tử tuyến trùng ................................................... 32 2.2.8. Phương pháp thử nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ tuyến trùng của nấm ...................................................................................................................................... 33 2.2.9. Phân tích số liệu ................................................................................................ 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................... 35 3.1. Thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở Việt Nam ............................ 35 iv 3.2. Đặc điểm hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt .... 39 3.2.1. Giống Tylenchorhynchus Cobb, 1913 .............................................................. 39 3.2.2. Giống Helicotylenchus Steiner, 1945 ............................................................... 47 3.2.3. Giống Hoplolaimus Von Daday, 1905 ............................................................. 53 3.2.4. Giống Rotylenchulus Linford & Oliveira, 1940 ............................................. 56 3.2.5. Giống Hemicriconemoides Chitwood & Birchfield, 1957 .............................. 61 3.2.6. Giống Mesocriconema Andrássy, 1965 ........................................................... 66 3.2.7. Giống Hemicaloosia Ray & Das, 1978 ............................................................. 70 3.2.8. Giống Xiphinema Cobb, 1913 .......................................................................... 74 3.2.9. Giống Meloidogyne Goeldi, 1892 ..................................................................... 76 3.2.10. Giống Pratylenchus Filipjev, 1936 ................................................................. 94 3.3. Các nhóm tuyến trùng kí sinh quan trọng trên cà rốt ở Việt Nam .................. 131 3.3.1. Phương thức gây hại của tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ............................. 131 3.3.2. Triệu chứng gây hại ........................................................................................ 132 3.3.3. Mật độ và tần suất xuất hiện của các giống tuyến trùng kí sinh trên cà rốt................................................................................................................................... 136 3.4. Ảnh hưởng của 2 loài nấm đối kháng đến tuyến trùng M. incognita và P. penetrans .................................................................................................................. 143 3.4.1. Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm Paecilomyces sp. đến tuyến trùng M. incognita và P. penetrans .................................................................................... 143 3.4.2. Ảnh hưởng của dịch nhân nuôi nấm L. squarrosulus đến tuyến trùng M. incognita và P. penetrans .................................................................................... 148 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 154 4.1. Kết luận .................................................................................................................. 154 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................ 155 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 156 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 180 PHỤ LỤC I: ...................................................................................................................... 180 PHỤ LỤC II. .................................................................................................................... 181 PHỤ LỤC III. ................................................................................................................... 182 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CDA: Phân tích thống kê dựa trên phân tích khác biệt chuẩn (Canonical Discriminant Analysis) CT: Công thức DNA: Axit đê ôxi ribonucleic ĐC: Đối chứng IEBR: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật KHV: Kính hiển vi ML: Maximum Likelihood PL: Phụ lục SEM: Hiển vi điện tử quét vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở các vùng điều tra ........ 35 Bảng 3.2. Số đo con cái loài T. annulatus ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ...................................................................................................................................... 41 Bảng 3.3. Số đo con cái loài T. mashhoodi ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ...................................................................................................................................... 44 Bảng 3.4. Số đo con cái loài H. dihystera ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ...................................................................................................................................... 48 Bảng 3.5. Số đo con cái loài H. indicus ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác .. 51 Bảng 3.6. Số đo con cái loài H. chambus ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác 54 Bảng 3.7. Số đo con cái chưa trưởng thành loài R. reniformis ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ....................................................................................................... 57 Bảng 3.8. Số đo con đực chưa trưởng thành loài R. reniformis ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ................................................................................................ 58 Bảng 3.9. Số đo con cái loài H. strictathecatus ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ............................................................................................................................. 62 Bảng 3.10. Số đo con cái loài M. sphaerocephalum ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ....................................................................................................................... 67 Bảng 3.11: Số đo con cái loài Hemicaloosia sp. ký sinh ở cà rốt ............................... 71 Bảng 3.12. Số đo con cái loài X. brevicolle ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ...................................................................................................................................... 75 Bảng 3.13. Số đo ấu trùng loài M. incognita ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác .............................................................................................................................. 78 Bảng 3.14. Số đo con đực loài M. incognita ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ............................................................................................................................. 79 Bảng 3.15. Số đo con cái loài M. incognita ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ...................................................................................................................................... 81 Bảng 3.16. Số đo loài M. arenaria ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ......... 86 Bảng 3.17. Số đo loài M. graminicola ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ... 90 Bảng 3.18. Số đo loài P. coffeae ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác .............. 96 Bảng 3.19. Số đo loài P. penetrans ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ...... 102 vii Bảng 3.20. Số đo con cái loài P. thornei ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác .................................................................................................................................... 105 Bảng 3.21. Số đo loài P. zeae ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác ................ 108 Bảng 3.22. Số đo loài P. haiduongensis ký sinh trên cà rốt ....................................... 112 Bảng 3.23. Số đo con cái loài Pratylenchus sp. 1 ký sinh ở cà rốt .......................... 116 Bảng 3.24. Số đo con đực loài Pratylenchus sp. 1 ký sinh ở cà rốt ......................... 111 Bảng 3.25. Số đo loài Pratylenchus sp. 2 ký sinh ở cà rốt ........................................ 122 Bảng 3.26. Các chỉ số hình thái lượng sử dụng trong phân tích thống kê dựa trên phân tích khác biệt chuẩn ....................................................................................... 126 Bảng 3.27. Tỷ lệ cà rốt bị các dấu hiệu gây hại do tuyến trùng ................................ 134 Bảng 3.28. Mật độ và tần suất xuất hiện (%) của các giống tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở các vùng điều tra ........................................................................................ 137 Bảng 3.29. Ảnh hưởng của nấm Paecilomyces sp.đến tỷ lệ (%) nở trứng tuyến trùng M. incognita ............................................................................................................ 144 Bảng 3.30. Tỷ lệ (%) ấu trùng M. incognita chết do nấm Paecilomyces sp. .................... 145 Bảng 3.31. Tỷ lệ (%) tuyến trùng P. penetrans chết do nấm Paecilomyces sp. ...... 146 Bảng 3.32. Ảnh hưởng của nấm L. squarrosulus đến tỷ lệ (%) nở trứng tuyến trùng M. incognita. ............................................................................................................. 149 Bảng 3.33. Tỷ lệ (%) ấu trùng M. incognita chết do nấm L. squarrosulus ........... 150 Bảng 3.34. Tỷ lệ (%) tuyến trùng P. penetrans chết do nấm L. squarrosulus ....... 151 viii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Ảnh chụp KHV con cái loài T. annulatus ký sinh ở cà rốt ......................... 42 Hình 3.2. Ảnh chụp KHV loài T. mashhoodi ký sinh ở cà rốt .................................... 45 Hình 3.3. Đặc điểm sai khác giữa 2 loài T. annulatus và T. mashhoodi ký sinh ở cà rốt . ..................................................................................................................................... 46 Hình 3.4. Ảnh chụp KHV con cái loài H. dihystera ký sinh ở cà rốt ......................... 49 Hình 3.5. Ảnh chụp KHV con cái loài H. indicus ký sinh ở cà rốt ............................. 52 Hình 3.6. Đặc điểm sai khác của 2 loài H. dihystera và H. indicus ký sinh ở cà rốt 53 Hình 3.7. Ảnh chụp KHV con cái loài H. chambus ký sinh ở cà rốt .......................... 55 Hình 3.8. Ảnh chụp KHV con trưởng thành non loài R. reniformis ký sinh ở cà rốt. ...................................................................................................................................... 60 Hình 3.9. Ảnh chụp KHV con cái loài H. strictathecatus ký sinh ở cà rốt. .............. 63 Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại dạng ML(mô hình TN93+G) dựa trên vùng gen D2D3 của các loài Hemicriconemoides spp. . ........................................................ 65 Hình 3.11. Ảnh chụp KHV con cái loài M. sphaerocephalum ký sinh ở cà rốt. ....... 68 Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại dạng ML (mô hình TN93+G) dựa trên vùng gen D2D3 của các loài Mesocriconema spp. ......................................................... 70 Hình 3.13: Ảnh chụp KHV con cái loài Hemicaloosia sp. ký sinh ở cà rốt .............. 73 Hình 3.14. Ảnh chụp KHV con cái loài X. brevicolle ký sinh ở cà rốt ...................... 76 Hình 3.15. Ảnh chụp KHV loài M. incognita ký sinh ở cà rốt .................................... 83 Hình 3.16. Ảnh chụp KHV loài M. arenaria ký sinh ở cà rốt ..................................... 88 Hình 3.17. Ảnh chụp KHV loài M. graminicola ký sinh ở cà rốt ............................... 91 Hình 3.18. Đặc điểm sai khác của ba loài tuyến trùng Meloidogyne spp. ký sinh trên cà rốt. ......................................................................................................................... 92 Hình 3.19. Cây phát sinh chủng loại dạng ML (mô hình HKY+G) dựa trên vùng gen D2D3 của các loài Meloidogyne spp. . .................................................................... 94 Hình 3.20. Ảnh chụp KHV loài P. coffeae ký sinh ở cà rốt ......................................... 98 Hình 3.21. Đa dạng cấu trúc đuôi con cái loài P. coffeae ký sinh ở cà rốt ................ 99 Hình 3.22. Ảnh chụp KHV loài P. penetrans ký sinh ở cà rốt .................................. 104 Hình 3.23. Ảnh chụp KHV con cái loài P. thornei ký sinh ở cà rốt ......................... 106 Hình 3.24. Ảnh chụp KHV con cái loài P. zeae ký sinh ở cà rốt .............................. 110 ix Hình 3.25. Ảnh chụp KHV con cái loài P. haiduongensis ký sinh ở cà rốt............. 113 Hình 3.26. Ảnh chụp KHV điện tử quét (SEM) con cái loài P. haiduongensis ký sinh ở cà rốt. .............................................................................................................. 114 Hình 3.27. Ảnh chụp KHV loài Pratylenchus sp. 1 ký sinh ở cà rốt ....................... 119 Hình 3.28. Các dạng đuôi con cái loài Pratylenchus sp. 1 ký sinh ở cà rốt. ............ 119 Hình 3.29. Ảnh chụp KHV điện tử quét (SEM) con trưởng thành loài Pratylenchus sp. 1 ký sinh trên cà rốt. .......................................................................................... 120 Hình 3.30. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) vùng môi con cái loài Pratylenchus sp1 và loài P. penetrans ................................................................... 121 Hình 3.31. Ảnh chụp KHV loài Pratylenchus sp. 2 ký sinh ở cà rốt. ....................... 123 Hình 3.32. Ảnh chụp KHV điện tử quét (SEM) con trưởng thành loài Pratylenchus sp. 2 ký sinh ở cà rốt. . ...................................................................................................... 124 Hình 3.33. Ảnh chụp KHV điện tử quét (SEM) vùng môi con cái loài Pratylenchus sp. 2 và P. penetrans ................................................................................................ 125 Hình 3.34. Ảnh chụp KHV điện tử quét (SEM) vùng môi con cái loài Pratylenchus sp. 2 và Pratylenchus sp. 1 ...................................................................................... 125 Hình 3.35. CDA các quần thể con cái tuyến trùng Pratylenchus spp. ký sinh trên cà rốt . ...................................................................................