Luận văn Ảnh hưởng của antistress lên khảnăng đề kháng edwardsiella ictaluricủacá tra (pangasianodon hypophthalmus

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN HOA CÚC ẢNH HƯỞNG CỦA ANTISTRESS LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG Edwardsiella ictaluri CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN HOA CÚC ẢNH HƯỞNG CỦA ANTISTRESS LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG Edwardsiella ictaluri CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH KS. ĐẶNG THỤY MAI THY KS. NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i TÓM TẮT Thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của Antistress lên khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra thông qua việc phân tích huyết học sau cho ăn Antistress và theo dõi tỉ lệ chết sau cảm nhiễm. Cá tra giống khỏe cho ăn thức ăn đối chứng có hàm lượng 0% Antistress trong 1 tuần. Sau đó, cá được bố trí thành 4 nghiệm thức cho ăn thức ăn có hàm lượng 0%; 0,2%; 0,4%; 0,6% Antistress trong 8 tuần. Cá còn lai sau thu mẫu huyết học được tiêm 0,1ml vi khuần Edwardsiella ictaluri CAF255, nồng độ 1,2x106tb/ml. Kết quả thu được, số lượng hồng cầu tăng có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức bổ sung 0,4%và 0,6% Antistress so với nghiệm thức đối chứng và trước cho ăn. Tổng bạch cầu, tiểu cầu cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress. Trong khi đó, nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress lại có số lượng bạch cầu trung tính cao nhất; tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân lại cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress. Tuy nhiên, tất cả sự chênh lệch về bạch cầu không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức. Bạch cầu đơn nhân, đại thực bào tăng trong cùng nghiệm thức trước và sau khi gây cảm nhiễm. Trong khi đó, hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu lại giảm. Giữa các nghiệm thức sau khi gây cảm nhiễm, số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress. Bạch cầu đơn nhân; đại thực bào cao nhất nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress. Bạch cầu trung tính cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress. Sau cảm nhiễm, thu được tỉ lệ cá chết thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress là 83%. Tỉ lệ cá chết cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress là 100%. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii LỜI CẢM TẠ Chân thành gửi lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh cùng quý thầy cô Bộ môn sinh học và bệnh Thủy Sản đã hết lòng hướng dẫn cũng như luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin gửi lời biết ơn chân thành đến cô Đặng Thụy Mai Thy và chị Nguyễn Thị Thúy Liễu đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp Và cũng xin chân thành biết ơn sâu sắc gia đình và những người thân đã tạo mọi điều kiện, sự động viên, tình yêu thương về vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian học và hoàn thành luận văn. Gửi lời cảm tạ đến tập thể lớp BHTS - K31 đã hết lòng ủng hộ, quan tâm, giúp đõ trong suốt thời gian qua. Chân thành cảm tạ! PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC Trang Tóm tắt .................................................................................................................... i Lời cảm tạ .............................................................................................................. ii Mục lục ................................................................................................................. iii Danh sách hính ...................................................................................................... v Danh sách bảng ..................................................................................................... vi Danh mục từ viết tắc ............................................................................................ vii Chương 1: Giới thiệu ............................................................................................. 1 Chương 2: Lược khảo tài liệu ................................................................................ 3 2.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra ....... 3 2.2 Bệnh lí và sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học .................................................. 3 2.3 Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm gần đây ..................................................... 6 2.4 Sản phẩm Antitress và vai trò của vitamin, chất khoáng đối với sức khỏe của cá. ........................................................................................................................... 7 Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu................................................... 9 3.1 Thời gian thực hiện đề tài ................................................................................ 9 3.2 Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 9 3.3 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 9 3.4 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 9 3.5 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 13 Chương 4: Kết quả và thảo luận .......................................................................... 14 4.1 Thí ngiệm 1 .................................................................................................... 14 4.1.1 Về hồng cầu ................................................................................................ 14 4.1.2 Bạch cầu ..................................................................................................... 15 4.2 Thí nghiệm 2 .................................................................................................. 16 4.2.1 Hồng cầu ..................................................................................................... 16 4.2.2 Các loại bạch cầu ........................................................................................ 17 4.2.3 Kết quả tỉ lệ chết sau cảm nhiễm ................................................................ 22 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv 4.2.4 Kết quả phân lập vi khuẩn .......................................................................... 23 Chương 5: Kết luận và đề xuất ............................................................................ 26 5.1 Kết luận .......................................................................................................... 26 5.2 Đề xuất ........................................................................................................... 26 Tài liệu tham khảo ............................................................................................... 27 Phụ lục ................................................................................................................. 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Tế bào hồng cầu ...................................................................................... 3 Hình 2.2 Tế bào lympho ........................................................................................ 4 Hình 2.3 Tiểu cầu .................................................................................................. 4 Hình 2.4 Bạch cầu đơn nhân ................................................................................. 5 Hình 2.5 Bạch cầu trung tính ................................................................................ 5 Hình 3.1 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu........................................................ 12 Hình 3.2 Buồng đếm hồng cầu ............................................................................ 12 Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức sau cho ăn Antistress ............................................................................................................. 14 Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện sự biến động số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức trước và sau cảm nhiễm ....................................................................................... 16 Hình 4.3 Các loại tế bào máu .............................................................................. 21 Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ chết giữa các nghiệm thức sau cảm nhiễm E.ictaluri ............................................................................................................................. 22 Hình 4.5 Kết quả phân lập vi khuẩn ................................................................ 24 Hinh 4.6 Kết quả nhuộm Gram ...................................................................... 24 Hình 4.7 Kết quả test sinh hóa (OF, H2S, nitrate, indole) ................................... 24 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vi DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu TTN và các NT sau cho ăn ... .15 Bảng 4.2A Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức I trước và sau cảm nhiễm ........................................................................................................... 17 Bảng 4.2B Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức II trước và sau cảm nhiễm ........................................................................................................... 18 Bảng 4.2C Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức III trước và sau cảm nhiễm .................................................................................................... 18 Bảng 4.3D Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức IV trước và sau cảm nhiễm .................................................................................................... 19 Bảng 4.3 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu giữa các nghiệm thức sau cảm nhiễm ................................................................................................................... 20 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) Trước cảm nhiễm (TCN) Sau cảm nhiễm (SCN) Trước thí nghiệm (TTN) Đối chứng (ĐC) Nghiệm thức (NT) Tổng bạch cầu (TBC) Hồng cầu (HC) Tiểu cầu (T) Tế bào lympho (L) Tế bào mono (M) Neutrophil (N) Đại thực bào (ĐTB) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Cá tra được xem là loài cá kinh tế được nuôi phổ biến ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Cá thịt không chỉ được tiêu thụ nội địa mà còn là mặt hàng xuất khẩu lớn sang các nước Châu Âu và Mỹ. Hệ quả của việc nuôi cá tra phát triển nhanh không theo quy hoạch dẫn đến hiện trạng bệnh trên cá nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều, diễn biến ngày càng phức tạp hơn. Các bệnh thường gặp trên cá tra như: bệnh do ký sinh trùng, vi khuẩn, bệnh do môi trường, dinh dưỡng…trong đó bệnh mủ gan hay còn gọi là gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đang rất phổ biến, ảnh hưởng lớn đến giai đoạn cá hương, cá giống và cả cá nuôi thương phẩm với tỉ lệ chết cao (10- 90%), gây thiệt hại lớn cho người nuôi (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Theo tập quán sản xuất của người nuôi cá khi có bệnh là nghĩ ngay đến việc dùng thuốc kháng sinh để điều trị và khi sử dụng lại không chú ý nhiều đến hướng dẫn, công dụng, liều lượng và thời gian sử dụng. Việc sử dụng thuốc kháng sinh trong một thời gian dài dẫn đến hiện tượng kháng thuốc, khi cá phát bệnh sẽ mạnh hơn và việc điều trị khó khăn tốn kém hơn nhiều. Theo điều tra của Nguyễn Tấn Duy Phong, (2008) trên cá tra nuôi ao thâm canh ở hai tỉnh Cần Thơ và An Giang thì chi phí cho thuốc thú y thủy sản là rất lớn (chiếm hơn 7% tổng chi phí sản xuất). Việc lạm dụng kháng sinh và thuốc thú y thủy sản không chỉ tốn kém mà còn làm cho sản phẩm cá tra, basa của Việt Nam gặp nhiều bất lợi khi xuất khẩu sang các thị trường trên thế giới. Để đảm bảo sức khỏe của người tiêu dùng nói chung cũng như đáp ứng tốt các yêu cầu và đòi hỏi ngày càng khắc khe của các thị trường thì việc hạn chế sử dụng kháng sinh, lựa chọn những phương pháp phòng bệnh bằng các giải pháp tích cực làm tăng cường sức đề kháng của cá nuôi đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Do đó, việc cung cấp thức ăn đầy đủ dinh dưỡng cũng như lựa chọn các sản phẩm bổ sung với thành phần chính là các vitamin và chất khoáng để kích thích hệ thống miễn dịch của cá, đặc biệt là hệ thống miễn dịch không đặc hiệu là một hướng đi tích cực trong việc phòng trị bệnh cá ngày nay. Antistress là một hỗn hợp bao gồm vitamin C, b-glucan và khoáng selenium hữu cơ được bổ sung vào thức ăn nhằm tăng cường sức kháng bệnh của cá tra. Vấn đề được đặt ra cho nhà sản xuất là cần có sự đánh giá chính xác về hiệu quả sử dụng cũng như liều lượng Antistress hợp lí cần bổ sung vào thức ăn. Xuất phát từ những thực tế trên đề tài “Ảnh hưởng của Antistress lên khả năng đề kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra” được thực hiện. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 Với mục tiêu: tìm hiểu ảnh hưởng của Antistress lên khả năng đề kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra. Nội dung đề tài: 1. Ảnh hưởng của Antistress lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra. 2. Hiệu quả sử dụng Antistress qua cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra E. ictaluri là vi khuẩn hình que, gram âm, không di động, lên men, không oxy hóa, oxidase âm tính, cho phản ứng catalase dương. Các chỉ tiêu sinh hóa của E. ictaluri đều âm tính, riêng lysine và glucose cho phản ứng dương tính Cá tra bị bệnh thường không có biểu hiện bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn sớm cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên khi bệnh nặng, cá gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Bên trong nội quan (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính 1-3 mm, các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũng ở thận. Bệnh thường xuất hiện vào mùa lũ cao điểm tháng 7 và tháng 8, gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra công nghiệp ở An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Bệnh gây tỉ lệ hao hụt cao ở cá hương, cá giống (10-90%), (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Bệnh lí và sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học Máu là thành phần quan trọng trong hệ tuần hoàn của tất cả các cơ thể sống. Thành phần các tế bào máu của hệ tuần hoàn cá trơn bao gồm hồng cầu, tế bào lympho, tiểu cầu, tế bào mono và các loại bạch cầu trung tính có hạt. Hồng cầu (Erythrocyte) Hồng cầu trưởng thành ở cá có hình tròn hoặc hình oval với nhân bắt màu đậm và kích thước từ 10x11µm-12x13µm, đường kính nhân 4-5µm. Hồng cầu chưa trửơng thành ít được tìm thấy trong vòng tuần hoàn máu, kích thước giống hồng cầu trưởng thành nhưng nhân lớn hơn. Tế bào chất bắt màu xanh nhạt hoặc xám bởi thuốc nhuộm Wright và Giemsa (Chinabut et al, 1991). Hình 2.1 Tế bào hồng cầu của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) E: hồng cầu thành thục R: hồng cầu chưa thành thục PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 Tế bào lympho (lymphocyte) Tế bào lympho ở cá da trơn nhỏ hơn hồng cầu, kích thước biến động 6-11µm. Tế bào có hình tròn, nhân chiếm toàn bộ tế bào bắt màu tím đậm khi nhuộm với Giemsa, tế bào chất nhỏ không rõ ràng và thường bắt màu xanh nhạt. Hình 2.2 Tế bào lympho của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) Tiểu cầu (thrombocyte) Hình dạng thay đổi, có thể là hơi tròn, dài hoặc hình thoi. Có vành mỏng của tế bào chất bao quanh nhân. Tế bào chất có màu xanh nhạt khi nhuộm với dung dịch Wright and Giemsa. Tiểu cầu tham gia vào quá trình đông máu trong trường hợp bị tổn thương (Chinabut et al, 1991). Hình 2.3 Tiểu cầu của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) Bạch cầu đơn nhân (monocyte) Bạch cầu đơn nhân là tế bào lớn nhất trong các dạng tế bào máu với đường kính 10-14µm, hình dạng không đều, chúng có tâm lệch, trong tế bào chất tồn tại những không bào có nhiều kích thước khác nhau. Nhân bắt màu xanh, tế bào chất bắt màu xanh nhạt (Chinabut et al, 1991). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 5 Hình 2.4 Bạch cầu đơn nhân của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) Bạch cầu trung tính (neutrophil) Tế bào lớn và tròn đường kính nhân 9-13µm với số lượng lớn của những hạt nhỏ trong tế bào chất màu xanh nhẹ hoặc hơi hồng. Nhân bắt màu xanh đậm, chia hai thuỳ ở tế bào thành thục và dạng tròn lệch tâm ở dạng chưa trưởng thành (Chinabut et al, 1991).. Hình 2.5 Bạch cầu trung tính của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) Không có bạch cầu ái toan hay bạch cầu ái kiềm được ghi nhận ở tế bào máu ngoại vi của cá trê, nhưng Williams and Waner (1976) đã tìm được 2 loại bạch cầu này trong máu cá nheo (Chinabut et al, 1991). Trần Hồng Ửng (2003) đã xác định sự thay đổi số lượng tế bào bạch cầu và mô tỳ tạng trên cá tra (P. hypophthalmus) bệnh trắng gan. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ tế bào lympho của cá bệnh giảm so với cá khỏe nhưng tỉ lệ bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính thì tăng cao hơn. Điều này chứng tỏ khi cá bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh thì trước hết hệ miễn dịch không đặc hiệu sẽ hoạt động do thành phần chính của hệ miễn dịch không đặc hiệu là bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính. Bạch cầu toan tính và bạch cầu kiềm tính có xuất hiện ở cá bệnh nhưng không có ở cá khỏe. Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng tế bào hồng cầu trên cá tra (P. hypophthalmus) bị bệnh vàng da của Phan Thị Hừng (2004). Nghiên cứu PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 6 cho thấy số lượng hồng cầu ở cá bệnh giảm hơn 50% so với cá khỏe, hồng cầu ở cá bệnh bị thoái hóa, khó phân biệt tế bào chất và nhân hoặc có những tế bào chỉ còn nhân, không còn tế bào chất. Theo Benli and Yildiz (2004) nghiên cứu về sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học trên cá rô phi ảnh hưởng bởi Edwardsiella tarda. Kết quả ghi nhận ở cá bệnh tổng bạch cầu tăng từ 12.00 ± 0,82 (x103µl-1) ở cá khỏe và cá bệnh là 21.75 ± 2.82 (x103µl-1) và có sự giảm số lượng hồng cầu ở cá bệnh so với cá khỏe và sự thay đổi này là có ý nghĩa thống kê. Phạm Thanh Hương (2006) xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra bệnh vàng da ở Cần Thơ. Nghiên cứu cũng cho thấy sự giảm trong số lượng hồng cầu, tế bào lympho và tiểu cầu. Trong khi đó tổng bạch cầu, bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính lại tăng. Tuy nhiên, sự thay đổi số lượng tổng bạch cầu, tế bào lympho và tiểu cầu lại không có ý nghĩa thống kê. Theo Nguyễn Thị Thuý Liễu (2008) cũng có sự thay đổi rõ rệt về số lượng các tế bào máu giữa cá tra khỏe và cá tra bị mủ gan. Sự thay đổi này biểu thị cho phản ứng bảo vệ không đặc hiệu của cá khi bị mầm bệnh tấn công. Số lượng hồng cầu trên cá khỏe là 2,05x106 tế bào/mm3, còn trên cá bệnh là 0,75x106 tế bào/mm3, giảm 63,4% so với cá khỏe. Đồng thời có sự xuất hiện hồng cầu nhiều nhân và hồng cầu không nhân ở cá bệnh. Số lượng bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân trên cá bệnh tăng cao nhưng chỉ có sự tăng của bạch cầu trung tính là có ý nghĩa thống kê. Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm gần đây Williams & Lawrence (2005) đã sử dụng vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT và R4383 HM với nồng độ lần lượt là 7,0x107CFU/ml và 7,2x107 CFU/ml ngâm trên cá nheo Mỹ trong thời gian 30 phút, tỉ lệ chết là 90% và 85%. Đồng thời, tác giả cũng sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri để so sánh với phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn tăng dần. Đối với vi khuẩn E. ictaluri