Luận văn Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự nảy mầm và sinh trưởng của cà rốt (daucus carota l.) và xà lách (lactuca sativa l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ________________________________________ Quách Văn Lợi ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘC TỐ VI KHUẨN LAM LÊN SỰ NẢY MẦM VÀ SINH TRƯỞNG CỦA CÀ RỐT (Daucus carota L.) VÀ XÀ LÁCH (Lactuca sativa L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ________________________________________ Quách Văn Lợi ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘC TỐ VI KHUẨN LAM LÊN SỰ NẢY MẦM VÀ SINH TRƯỞNG CỦA CÀ RỐT (Daucus carota L.) VÀ XÀ LÁCH (Lactuca sativa L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐÀO THANH SƠN TS. TRẦN THANH HƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào. Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định. TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 03 năm 2015 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Quách Văn Lợi LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: TS. ĐÀO THANH SƠN, khoa Môi trường và Tài nguyên – Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn. TS. TRẦN THANH HƯƠNG, Bộ môn Sinh Lý thực vật – Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và làm luận văn. Ban giám hiệu, phòng đào tạo Sau đại học, ban chủ nhiệm khoa Sinh học và bộ môn Sinh lý thực vật trường đại học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và làm luận văn ở trường. Các Thầy, Cô trong bộ môn sinh lý thực vật trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia TPHCM đã hỗ trợ cho em trong suốt thời gian làm luận văn ở trường. Các Thầy, Cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và góp nhiều ý kiến cho luận văn của em. ThS. Nguyễn Thanh Sơn công tác tại phòng thí nghiệm Độc học môi trường – Viện Môi trường và Tài nguyên – ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn. ThS. Hồ Thị Mỹ Linh công tác tại phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật – Đại học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn. Các bạn học viên lớp Sinh học thực nghiệm khóa 23 đã động viên, giúp đỡ tôi suốt quá trình làm luận văn. Cuối cùng, con xin cảm ơn gia đình đã luôn tạo điều kiện tốt nhất con trong suốt quá trình học tập và làm luận văn. QUÁCH VĂN LỢI MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 3 1.1. Độc tố vi khuẩn lam ................................................................................. 3 1.2. Nghiên cứu về ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên thực vật trên thế giới ................................................................................................................. 5 1.3. Nghiên cứu về độc tố vi khuẩn lam ở việt nam ....................................... 7 1.4. Giới thiệu về cà rốt và xà lách ............................................................... 10 1.1.1. Cây cà rốt ........................................................................................ 10 1.1.2. Cây xà lách ...................................................................................... 11 1.5. Phát triển của thực vật ........................................................................... 11 1.6. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự nảy mầm và tăng trưởng của cây mầm ............................................................................. 13 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 17 2.1. Vật liệu ................................................................................................... 17 2.1.1. Thực vật .......................................................................................... 17 2.1.2. Độc tố vi khuẩn lam ........................................................................ 17 2.1.3. Vật liệu sử dụng cho sinh trắc nghiệm ............................................ 17 2.2. Thiết kế thí nghiệm ................................................................................ 18 2.2.1. Khảo sát các biến đổi hình thái của hột trong quá trình nảy mầm .. 18 2.2.2. Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự nảy mầm ..................... 18 2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự phát triển của cà rốt và xà lách ................................................................................................. 18 2.2.4. Đo cường độ hô hấp của cây mầm cà rốt và xà lách ...................... 19 2.2.5. Đo hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có trong cây mầm xà lách và cà rốt .................................................................................. 19 2.2.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và độc tố microcystin trên sự phát triển của cây mầm ...................................... 23 2.3. Xử lý số liệu ........................................................................................... 23 2.4. Thời gian và nơi thực hiện đề tài ........................................................... 23 Chương 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ............................................................ 24 3.1. Kết quả ................................................................................................... 24 3.1.1. Các biến đổi hình thái trong quá trình nảy mầm ............................. 24 3.1.2. Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự nảy mầm ..................... 26 3.1.3. Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự phát triển của cây mầm cà rốt và xà lách ................................................................................................. 27 3.1.5. Sự thay đổi hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dưới ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam........................................................... 44 3.1.6. Ảnh hưởng kết hợp giữa độc tố vi khuẩn lam và chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự phát triển của cây mầm .................................................. 46 3.2. Thảo luận ............................................................................................... 55 3.2.1. Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam trên sự nảy mầm ................... 55 3.2.2. Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự tăng trưởng của cây mầm ................................................................................................................... 56 3.2.3. Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên khả năng hô hấp và tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ....................................................... 58 3.2.4. Mối liên hệ giữa độc tố vi khuẩn lam và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển của cây mầm .............................................. 58 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .............................................................................. 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 62 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA: Abcisic acid ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay GA3: Gibberellic acid HPLC: High Performance Liquid Chromatography IAA: Indole-3-acetic acid MC: Microcystin POD: Peroxidase SOD: Superoxide dismutase DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Tỉ lệ nảy mầm của hột cà rốt và xà lách ..................................... 27 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây mầm mù tạt (Sinapis alba L.) sau 7 ngày xử lý với độc tố microcystin 5 Hình 1.2. Cây cải dầu sau 10 ngày xử lý với microcystin ở các nồng độ khác nhau .. 6 Hình 1.3. Cây cà rốt ..................................................................................................... 10 Hình 1.4. Cây xà lách .................................................................................................... 11 Hình 2.1. Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật .................................. 21 Hình 3.1. Các giai đoạn trong quá trình nảy mầm của hột cà rốt ................................. 25 Hình 3.2. Các giai đoạn trong quá trình nảy mầm của hột xà lách .............................. 25 Hình 3.3. Sự thay đổi trọng lượng tươi của hột cà rốt và xà lách trong quá trình nảy mầm .................................................................................................................... 26 Hình 3.4. Chiều dài rễ cà rốt sau 2 ngày xử lý với độc tố vi khuẩn lam từ mẫu tạo váng .................................................................................................................... 28 Hình 3.5. Cây mầm xà lách 7 ngày sau khi xử lý với dịch chiết từ mẫu tạo váng (SCUM) chứa độc tố ở những nồng độ microcystin khác nhau ........................ 29 Hình 3.6. Cây mầm xà lách sau 7 ngày thí nghiệm với độc tố vi khuẩn lam từ dịch chiết mẫu tế bào in vitro .................................................................................... 30 Hình 3.7. Chiều dài rễ cà rốt ở những nghiệm thức khác nhau ................................... 31 Hình 3.8. Chiều dài rễ xà lách ở những nghiệm thức khác nhau ................................ 32 Hình 3.9. Chiều dài trụ hạ diệp cà rốt ở những nồng độ độc tố khác nhau .................. 34 Hình 3.10. Chiều dài trụ hạ diệp xà lách ở những nồng độ độc tố khác nhau ............. 35 Hình 3.11. Cây mầm xà lách 4 ngày sau khi xử lý với độc tố vi khuẩn lam từ dịch chiết mẫu tế bào in vitro ..................................................................................... 36 Hình 3.12. Trọng lượng tươi của cây mầm cà rốt ở các nồng độ độc tố khác nhau ..... 38 Hình 3.13. Trọng lượng tươi của cây mầm xà lách ở các nồng độ độc tố khác nhau ... 39 Hình 3.14. Đường kính của cây mầm cà rốt và xà lách ở các nồng độ độc tố khác nhau ................................................................................................................... 40 Hình 3.15. Cường độ hô hấp của cây mầm cà rốt ở các nồng độ độc tố khác nhau ..... 42 Hình 3.16. Cường độ hô hấp của cây mầm xà lách ở các nồng độ độc tố khác nhau... 43 Hình 3.17. Hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong cây mầm cà rốt và xà lách 4 ngày ở các loại độc tố khác nhau ............................................. 45 Hình 3.18. Chiều dài rễ cà rốt sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật ................................................................................................... 47 Hình 3.19. Chiều dài rễ xà lách sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật .................................................................................................. 48 Hình 3.20. Chiều dài trụ hạ diệp cà rốt sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật .................................................................................... 50 Hình 3.21. Chiều dài trụ hạ diệp xà lách sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật .................................................................................... 51 Hình 3.22. Khối lượng cà rốt sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật .................................................................................................. 53 Hình 3.23. Khối lượng xà lách sau khi xử lý với độc tố kết hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật .................................................................................................. 54 1 MỞ ĐẦU  Lí do chọn đề tài Việc gia tăng dân số, phát triển các ngành công nghiệp, nông nghiệp đã và đang làm gia tăng đáng kể các chất dinh dưỡng trong các thủy vực. Nguồn nước mặt giàu dinh dưỡng đặc biệt là nitơ và phospho, thường dẫn đến sự thay đổi của quần xã thực vật nổi và quần xã có xu hướng thống trị bởi vi khuẩn lam (hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam). Các chất dinh dưỡng (nitơ và phospho) là nguyên nhân chính gây nên hiện tượng phú dưỡng xảy ra ở hơn 54% hồ nước ngọt ở khu vực châu Á Thái Bình Dương trong nhiều năm trở lại đây. Nở hoa của vi khuẩn lam gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước như gây mùi khó chịu, làm giảm, cạn kiệt nguồn oxi hòa tan trong nước, làm giảm đa dạng sinh học. Nở hoa của vi khuẩn lam xuất hiện trong nhiều điều kiện môi trường, trong đó 25-75% các trường hợp nở hoa kèm theo sự hiện diện của độc tố vi khuẩn lam. Vi khuẩn lam có thể tiết ra những hợp chất thứ cấp trong đó có các độc tố. Độc tố vi khuẩn lam có nhiều loại khác nhau, trong đó microcystin là độc tố có cường độ mạnh và phổ biến nhất, với hơn 80 dạng đồng phân khác nhau đã được xác định. Sự có mặt của những độc tố này trong các thủy vực gây ảnh hưởng xấu đến những sinh vật sống trong thủy vực đó. Bên cạnh đó, việc sử dụng những nguồn nước có chứa những loại độc tố này nhằm phục vụ cho mục đích sinh hoạt có thể có những ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Ngoài ra, khi sử dụng cho hoạt động tưới tiêu trong nông nghiệp cũng có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật, từ đó làm ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Nhiều nghiên cứu về độc tính của độc tố vi khuẩn lam trên thế giới đã được tiến hành, tuy nhiên công bố về độc tính vi khuẩn lam và độc tố của chúng có nguồn gốc Việt nam thì vẫn còn rất khiêm tốn, rời rạc, những nghiên cứu chủ yếu tập trung vào động vật, trong khi đó ảnh hưởng của thực vật vi khuẩn lam lên thực vật thì vẫn chưa được quan tâm, nghiên cứu sâu. Do đó, đề tài “Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên 2 sự nảy mầm và sinh trưởng của cà rốt (Daucus carota L.) và xà lách (Lactuca sativa L.)” được đề xuất, với nguồn độc tố vi khuẩn lam lấy từ hồ Dầu Tiếng – hồ chứa cung cấp nước sinh hoạt và nông nghiệp cho một số tỉnh Đông Nam Bộ. Theo những nghiên cứu gần đây cho thấy hàm lượng microcystin trong nước hồ khá cao, do đó việc sử dụng nước hồ Dầu Tiếng chứa đựng mối nguy hiểm tiềm tàng đối với mùa màng và sức khỏe con người.  Mục đích nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam từ hồ Dầu Tiếng lên sự nảy mầm và phát triển của cây cà rốt và xà lách.  Giới hạn - phạm vi nghiên cứu Tìm hiểu ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự nảy mầm và phát triển của hột cà rốt và xà lách ở giai đoạn tăng trưởng trong khoảng thời gian 7 ngày tuổi trong điều kiện phòng thí nghiệm.  Ý nghĩa khoa học Đóng góp thêm kiến thức về sự tác động của độc tố vi khuẩn lam có nguồn gốc Việt Nam lên sự nảy mầm và phát triển ở cà rốt và xà lách.  Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài sẽ góp phần đánh giá độc tính sinh thái của vi khuẩn lam có nguồn gốc từ Việt Nam, khả năng ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam từ hồ Dầu Tiếng lên sản lượng nông nghiệp (cà rốt, xà lách) ở địa phương khi sử dụng nước hồ làm nước tưới trực tiếp cho cây trồng. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Độc tố vi khuẩn lam Vi khuẩn lam (cyanobacteria, cyanoprokaryota, cyanophyta, blue-green algae), còn có tên là tảo lam. Chúng là một trong những sinh vật xuất hiện sớm nhất trên Trái đất và tồn tại qua hàng tỉ năm. Vi khuẩn lam hầu như có mặt ở khắp mọi nơi, có khả năng chống chịu cao hơn so với thực vật đối với các điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, ánh sáng thấp, cạn kiệt dinh dưỡng...[33]. Vi khuẩn lam là những sinh vật chưa có màng nhân, và có khả năng quang tự dưỡng vô cơ và dùng H2O làm chất cho điện tử trong quá trình quang hợp. Vi khuẩn lam chứa chlorophyll a và các sắc tố như phycocyanin, phycobiliprotein. Một số loài có sắc tố đỏ phycoerythrin, chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu nâu. Vi khuẩn lam có thể đơn bào hoặc đa bào dạng sợi, không di động hoặc di động bằng cách trườn (gliding), một số loài có túi khí (gas vesicles). Nhiều loài có dị bào (heterocysts) và có khả năng cố định nitơ... Vi khuẩn lam sống đơn lẻ hoặc liên kết với nhau tạo thành các tập đoàn hình cầu hoặc các bó sợi lớn, có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Chúng phát triển trong các môi trường khác nhau, từ nước ngọt đến nước mặn, thậm chí sống trên đất ẩm hoặc cộng sinh trên các loài thực vật bậc cao thuộc họ đậu [33]. Trong thủy vực, vi khuẩn lam có thể chiếm đến 99,8% tổng mật độ thực vật phù du. Đồng thời chúng có thể dễ dàng nở hoa trong nhiều điều kiện môi trường trên khắp thế giới và ước tính khoảng 25 – 75% những nở hoa vi khuẩn lam có kèm theo độc tố. Vi khuẩn lam nở hoa có thể hủy hoại cảnh quan, ô nhiễm môi trường nước vì chúng gồm nhiều loài có thể sản sinh độc tố, ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước. Hơn 60 loài vi khuẩn lam có độc tố đã được liệt kê thuộc các giống như Microcystis, Anabaena, Aphanizomenon, Planktothrix, Cylindrospermopsis, Anabaenopsis, Nostoc, Raphidiopsis, Nodularia. Một chủng vi khuẩn lam có thể sản sinh ra nhiều loại độc tố, ngược lại một loại độc tố có thể được tạo ra bởi nhiều loài vi khuẩn lam có độc [16]. 4 Dựa trên độc tính ảnh hưởng lên động vật, độc tố vi khuẩn lam được theo làm 5 nhóm như sau: (i) độc tố gan (hepatoxins) bao gồm: microcystins, nodularins; (ii) độc tố thần kinh (neurotoxins) bao gồm: anatonxin-a, anatoxin-a(S), homoanatoxin-a; (iii) độc tố gây ngứa da, tiêu chảy: aplysiatoxins, debromoaplysiatoxin; (iv) nhóm độc tố tế bào: cylindrospermopsin (gây đột biến nhiễm sắc thể hay đứt gãy DNA); (v) nội độc tố lipopolysaccharides. Ngoài ra, hàng trăm hợp chất có hoạt tính sinh học đã được tìm thấy trong nhiều chi vi khuẩn lam như Microcystis, Planktothrix, Oscillatoria, Aphanizomenon, Anabaeba, Cylindrospermopsis, Nostoc, Nodularia, Lyngbya, Schizothrix, Plectonema, Westiellopsis, Scytonema và Hapalosiphon [33]. Độc tố microcystin (MC) dùng thí nghiệm được tạo ra từ nhiều chi vi khuẩn lam khác nhau như: Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Nostoc, Anabaenopsis, Hapalosiphon, Arthrospira fusiformis, Annamia toxica, Merismopedia tenuissima, Leptolyngbya boryana. MC là cấu trúc dạng vòng phổ biến, được mô tả là một heptapeptide dạng vòng chứa D- và L-amino acid cộng với N-methylldehydroalanine và một nhóm β-amino acid duy nhất bên cạnh, acid 3-amino-9-methoxy-2-6,8- trymethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic. Những đồng phân của MC khác nhau cơ bản ở hai L-amino acid, và khác nhau thứ hai là sự hiện diện hoặc biến mất của nhóm methyl trên acid D-erythro-β-methylaspartic (D-MeAsp) và/hoặc N-methyldehydroalanine (Mdha) [33]. Cơ chế gây độc của microcystins liên quan chặt chẽ với quá trình ức chế protein phosphatases 1 và 2A. Sự ức chế protein này dẫn đến quá tải quá trình phosphoryl hóa của những cấu trúc dạng sợi, sau đó bộ xương tế bào bị thoái hóa và phá vỡ cấu trúc tế bào. Sự co rút của tế bào gan từ những tế bào lân cận và những mao mạch hình sin làm máu trở nên ức đọng trong những mô gan. Kết quả sau cùng là phá hủy những mô gần đó, bộ phận bị hư hại và gây xuất huyết [33]. 5 1.2. Nghiên cứu về ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên thực vật trên thế giới Kurki-Helasmo và Meriluoto (1998) đã nghiên cứu về tác động của MC lên sự phát triển của hột giống mù tạt (Sinapis alba L.) sau 7 ngày xử lý độc tố ở những nồng độ khác nhau. Dạng đồng phân MC-RR ức chế sự phát triển của cây con và hình thành những cây con dị dạng ở nồng độ MC ≥ 5,0 μg/mL. MC-LR ức chế quá trình khử phospho của những protein bên trong cây dẫn đến những rối loạn trong sự phát triển rễ và những bộ phận khác. Đặc điểm của những cây con bị ức chế sự kéo dài rễ và lá non [21]. Pfugmacher (1998) cho rằ