Luận văn Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nhiễm edwardsiella ictaluri

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ NGỌC LAN VÂN ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC KHÁNG SINH LÊN CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM Edwardsiella ictaluri LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version LỜI CẢM TẠ Xin gởi lời cảm ơn đến cô Đặng Thụy Mai Thy, cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị Thúy Liễu đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Mình xin chân thành cảm ơn những người bạn thân yêu của lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã luôn gắn bó, quan tâm, giúp đỡ mình trong 4 năm đại học. Lời cảm ơn cuối cùng con xin gởi đến cha mẹ, cha mẹ là nguồn động viên lớn nhất giúp cho con vượt qua những lúc khó khăn , giúp con có đủ tự tin trong học tập và trong cuộc sống. Chân thành cảm ơn! PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i TÓM TẮT Đề tài “ Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm Edwardsiella ictaluri” nhằm mục tiêu xác định ảnh hưởng của các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi cá tra lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra nhiễm E. ictaluri. Cá tra giống mua về có biểu hiện bệnh mủ gan, tiến hành bố trí thí nghiệm với 7 nghiệm thức trong đó có 6 nghiệm thức sử dụng kháng sinh, nghiệm thức 1 – Amoxicilin, nghiệm thức 2 – Flofenicol, nghiệm thức 3 – Docycilin, nghiệm thức 4 – Flofenicol và Amoxicillin, nghiệm thức 5 – Flofenicol và Doxycilin và nghiệm thức 6 - Amoxicillin và Doxycilin, 1 nghiệm thức đối chứng không sử dụng kháng sinh. Theo dõi tỉ lệ chết của cá, tiến hành phân lập vi khuẩn và lấy máu xác định các chỉ tiêu huyết học trên những cá có biểu hiện lờ đờ. Kết quả thí nghiệm cho thấy tỉ lệ chết ở nghiệm thức 1 cao nhất (100% cá chết vào ngày thứ 3 thí nghiệm), kế đến là nghiệm thức đối chứng (93,3%), nghiệm thức 2 (93%), nghiệm thức 3 (47%), nghiệm thức 4 (43%), nghiệm thức 5 và 6 (30%). . Kết quả phân lập vi khuẩn xác định cá nhiễm bệnh do E.ictaluri. Trong máu tìm được 5 loại tế bào: hồng cầu, lympho, tiểu cầu, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính. Ngoài ra còn tìm thấy hồng cầu nhiều nhân và không nhân. Hồng cầu được định loại bằng dung dịch Natt – Herick, bạch cầu bằng phương pháp nhuộm Wright & Giemsa. Số lượng hồng cầu của cá sau khi điều trị bằng kháng sinh là 1,6x106 tế bào/mm3 thấp hơn hồng cầu của cá nhiễm bệnh trước khi sử dụng kháng sinh là 1,8x106 tế bào/mm3, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Lympho sau sử dụng kháng sinh thấp hơn trước khi sử dụng kháng sinh còn bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính sau sử dụng kháng sinh cao hơn trước khi sử dụng kháng sinh. Đối với từng nghiệm thức, lympho và bạch cầu trung tính ở nghiệm thức không sử dụng kháng sinh có số lượng thấp nhất (13,3x103 tế bào/mm3 và 7,3x103 tế bào/mm3), số lượng lympho cao nhất ở nghiệm thức 6 (53,8x103 tế bào/mm3) và bạch cầu trung tính cao nhất ở nghiệm thức 2 (16,6x103 tế bào/mm3). Số lượng bạch cầu đơn nhân cao nhất ở nghiệm thức 2 với 12,8x103 tế bào/mm3 và tiểu cầu cao nhất với số lượng 24.6x103 tế bào/mm3 ở nghiệm thức 6. Nghiệm thức 5 có số bạch cầu đơn nhân thấp nhất (5,1x103 tế bào/mm3) và nghiệm thức 2 có số tiểu cầu thấp nhất (5,3x103 tế bào/mm3). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii MỤC LỤC Tóm tắt ............................................................................................................ i Mục lục ............................................................................................................ ii Danh sách bảng ............................................................................................... iv Danh sách hình ................................................................................................. v CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ............................................................................... 1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................... 2 2.1 Tình hình dịch bệnh trên cá tra ............................................................... 2 2.2 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra .......................................................... 2 2.3 Bệnh mủ gan trên cá ............................................................................... 2 2.4 Tình hình quản lý sử dụng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam ......................................................................................... ..............3 2.5 Kháng sinh .............................................................................................. 4 2.5.1 Khái niệm ....................................................................................... 4 2.5.2 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh .......................................... 4 2.5.3 Các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong thủy sản ................. 5 2.6 Những nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E.ictaluri ...................................................................................................... 6 2.7 Các chỉ tiêu huyết học ........................................................................... 7 2.7.1 Hồng cầu ( Erythrocyte) ................................................................ 8 2.7.2 Bạch cầu đơn nhân ........................................................................ 8 2.7.3 Bạch cầu trung tính ( Neutrophil) ................................................. 9 2.7.4 Tiểu cầu ( Thrombocyte ................................................................ 9 2.7.5 Tế bào lympho ( lymphocyte) ....................................................... 10 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii 3.1 Thời gian thực hiện ............................................................................... 11 3.2 Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 11 3.3 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 11 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu .................................................................. 11 3.3.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ................................................... 11 3.3.3 Hóa chất ....................................................................................... 11 3.4 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 12 3.4.1 Chuẩn bị thí nghiệm ..................................................................... 12 3.4.2 Bố trí thí nghiệm .......................................................................... 12 3.4.3 Các chỉ tiêu thu thập ..................................................................... 12 3.5 Định danh vi khuẩn ............................................................................... 13 3.6 Phương pháp lấy mẫu máu quan sát các chỉ tiêu huyết học ................. 13 3.6.1 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm hống cầu ................. 13 3.6.2 Phương pháp lấy mẫu máu, nhuộm và đếm bạch cầu .................. 14 3.7 Xử lý số liệu .......................................................................................... 15 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................ 16 4.1 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................... 16 4.2 Kết quả thí nghiệm ............................................................................... 16 4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn ................................................................... 17 4.4 Kết quả phân tích huyết học ................................................................ 18 4.4.1 Hồng cầu ..................................................................................... 18 4.4.2 Bạch cầu ....................................................................................... 20 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT..................................................... 24 5.1 Kết luận ................................................................................................. 24 5.2 Đề xuất .................................................................................................. 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 25 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv Phụ lục ............................................................................................................ 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 So sánh độ nhạy của các loại kháng sinh đối với vi khuẩn E.ictaluri phân lập trên cá tra bệnh gan thận mủ (nguồn: Nguyễn Đức Hiền) ................ 8 Bảng 3.1 Các loại thuốc và liều lượng kháng sinh sử dụng cho các nghiệm thức thí nghiệm ............................................................................................... 12 Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu trước và sau khi sử dụng kháng sinh ....................................................................................................... 20 Bảng 4.2 Số lượng các loại bạch cầu ở các nghiệm thức sau khi sử dụng kháng sinh ................................................................................................................. 21 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Cá tra bệnh xuất hiện nhiều đốm trắng trên gan (G), thận (Th) và tỳ tạng (Tt)). .............................. 3 Hình 2.2 Tế bào hồng cầu ............................................................................... 8 Hình 2.3 Bạch cầu đơn nhân ............................................................................ 9 Hình 2.4 Bạch cầu trung tính .......................................................................... 9 Hình 2.5 Tiểu cầu ........................................................................................... 10 Hình 2.6 Tế bào lympho ................................................................................ 10 Hình 3.1 Buồng đếm hồng cầu ....................................................................... 13 Hình 3.2 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu .................................................. 14 Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ chết của các nghiệm thức trogn quá trình thí nghiệm ........................................................................................................... 16 Hình 4.2 Khuẩn lạc trên môi trường TSA ..................................................... 17 Hình 4.3 Kết quả nhuộm gram ................................................................................ 18 Hình 4.4 Kết quả kiểm tra các loai đường ............................................................ 18 Hình 4.5 Hồng cầu nhiều nhân (100X) .......................................................... 18 Hình 4.6 Hồng cầu không nhân (100X) ......................................................... 18 Hình 4.7 Biểu đồ mật độ hồng cầu cá tra trước, sau khi sử dụng kháng sinh và không sử dụng kháng sinh .............................................................................. 19 Hình 4.8 Tế bào lympho (100X) .................................................................... 20 Hình 4.9 Tiểu cầu (100X)............................................................................... 20 Hình 4.10 Bạch cầu trung tính (100X) ........................................................... 20 Hình 4.11 Bạch cầu đơn nhân (100X) ............................................................ 20 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Nghề nuôi trồng thuỷ sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành có đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu. Hiện tại, nhu cầu cá tra cho xuất khẩu và tiêu thụ trong nước đều tăng cao. Giải pháp quan trọng để tạo thêm nhiều sản phẩm là nuôi công nghiệp tập trung. Song song với sự phát triển đó, vấn đề dịch bệnh trên cá tra nuôi ngày càng trở nên trầm trọng. Tình hình dịch bệnh xuất hiện nhiều hơn khi vào mùa mưa, chủ yếu là bệnh gan thận có mủ, trắng gan, trắng mang. Theo thống kê của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, diện tích nuôi cá tra ở ĐBSCL giảm hơn trước, tính đến ngày15/8/2008, diện tích thả nuôi của các tỉnh An Giang là 1.392 ha, Cần Thơ - 1.250 ha, Đồng Tháp - 630 ha, Bến Tre - 563 ha, Vĩnh Long - 221 ha, Sóc Trăng - 212 ha, Hậu Giang - 171 ha và Tiền Giang - 118 ha (Dương Long Trì, 2008). Để hạn chế dịch bệnh người nuôi đã sử dụng một số loại kháng sinh. Việc dùng kháng sinh trị bệnh thường tốn kém và hiệu quả không cao. Theo điều tra của Nguyễn Tấn Duy Phong ( 2008) về tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản ở 2 tỉnh Cần Thơ và An Giang cho thấy chi phí cho việc sử dụng thuốc thú y thủy sản là rất lớn, chiếm hơn 7% tổng chi phí sản xuất. Hơn nữa lượng tồn dư kháng sinh không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, mà còn ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng. Việc dùng kháng sinh tùy tiện, không đúng loại, liều lượng và cách thức điều trị đã đưa đến hiệu quả điều trị của kháng sinh ngày càng giảm và tạo ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc. Từ thực tế nêu trên, đề tài “ Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm Edwardsiella ictaluri” được thực hiện với mục tiêu xác định ảnh hưởng của các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi cá tra lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra khỏe và cá bị nhiễm E. ictaluri. Nội dung đề tài: - Xác định ảnh hưởng của các loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi cá tra lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra nhiễm E. ictaluri. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh trên cá tra Tình hình dịch bệnh trên cá tra của các tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu Long trong năm 2007 cho thấy các bệnh thường xảy ra và gây thiệt hại cho người nuôi đó là bệnh gan, thận có mủ (đốm trắng trên gan, thận) với tần suất xuất hiện cao (52,8%), kế đến là bệnh xuất huyết (42,5%), phù đầu, phù mắt (20,7%), vàng da và thân (21,6%). Riêng bệnh gan, thận có mủ (đốm trắng trên gan, thận) thì An Giang chiếm tỉ lệ cao nhất đạt 66,7%, kế đến là Cần Thơ: 54,89%, Vĩnh Long 53,8%, Đồng Tháp 36%. Bệnh thường xảy ra từ tháng 5 đến tháng 9 vào mùa nước xoay ở đồng bằng sông Cửu Long, đỉnh điểm rơi vào tháng 9-10; đặc biệt bệnh xuất hiện không phụ thuộc vào mùa vụ thả giống hay lứa tuổi cá. 2.2 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra Bệnh mủ gan được phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam năm 1998. Đây là một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra, basa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khoảng 61% không cao hơn nhiều so với các bệnh khác như bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ 68,3%, bệnh phù đầu 51,2% . Bệnh mủ gan là một trong các nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tỷ lệ hao hụt cao, đặc biệt giai đoạn cá giống và cá nuôi thương phẩm dưới 3 tháng tuổi. Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra phát triển mạnh mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ (huyện Thốt Nốt, Phụng Hiệp) (Từ Thanh Dung và ctv, 2002) 2.3 Bệnh mủ gan trên cá tra Theo Từ Thanh Dung và ctv (2002), giống như những bệnh khác, cá mắc bệnh mủ gan có biểu hiện lờ đờ, không có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá kém ăn, nhưng nếu không áp dụng các phương pháp điều trị và không giảm lượng thức ăn thì bệnh sẽ trở nên trầm trọng hơn và rất khó điều trị. Phần nội quan có những đốm trắng, đường kính 1-3mm. Trên gan, thận, tỳ tạng sưng to nhất là thận sẽ bị sưng và nhũng. Tỉ lệ chết từ 10-90% tổng số cá nuôi trong bè. Nguyên nhân của bệnh này là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 Hình 2.1 Cá tra bệnh xuất hiện nhiều đốm trắng trên gan (G), thận (Th) và tỳ tạng (Tt) (Từ Thanh Dung và ctv, 2002). E. ictaluri là vi khuẩn hình que, gram âm, không di động, lên men, không oxy hóa, oxidase âm tính, cho phản ứng catalase dương tính. Các chỉ tiêu sinh hóa của E. ictaluri đều âm tính, riêng lysine và glucose cho phản ứng dương tính. Phản ứng indole và H2S âm tính (Từ Thanh Dung và ctv, 2002). 2.4 Tình hình quản lý sử dụng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới Nhận rõ sự nguy hiểm của kháng sinh trong thủy sản gây ảnh hưởng trực tiếp đến người tiêu dùng do vậy thị trường bên ngoài đã có nhiều biện pháp nhằm kiểm soát dư lượng kháng sinh an toàn vệ sinh thực phẩm thủy sản. Cụ thể ở một số thị trường bên ngoài mà Việt Nam hướng vào như Canada, Trung Quốc, Hàn Quốc, EU, Mỹ… đã ban hành những văn bản pháp lý làm rào cản trong việc kiểm soát dư lượng kháng sinh tồn tại trong sản phẩm thủy sản (Nguyễn Ngọc Hải, 2004). Ở Việt Nam Qua khảo sát của Nguyễn Ngọc Hải (2004) cho thấy người ương cá đều dùng thuốc hay hóa chất với nhiều chủng loại khác nhau. Tỉ lệ thuốc kháng sinh nguyên liệu và thuốc có nguồn gốc kháng sinh chiếm đa số với 23 loại kháng sinh là nguyên liệu gốc và 27 loại có chứa thành phần phối chế chuyên dùng như kháng sinh, tỉ lệ thuốc kháng sinh chiếm số lượng lớn (40,65%) trong cơ cấu thuốc. Ngoài ra, có nhiều loại thuốc được dùng có tên gọi không rõ ràng (12% số hộ), 6 loại đã được quy định giới hạn sử dụng tối đa: ampicillin, tetracillin, oxytetracillin, amoxicillin, cloxacillin, sulfonamide; 1 loại bị cấm hoàn toàn : chloramphenicol đều có xuất hiện trong danh mục sử dụng ở vùng Hồng Ngự. Mức độ đầu tư cho khoảng chi phí thuốc và hóa chất phòng trị PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 bệnh khá cao, đa phần các hộ đều không nhớ hết những loại đã sử dụng và số lần phải dùng để điều trị trong năm, ước lượng chiếm từ 8- 31% ( trung bình 15,7%) tổng chi phí vụ ương. Theo điều tra của Nguyễn Chính (2005) ở 2 tỉnh An Giang và Cần Thơ về tình hình sử dụng thuốc và hóa chất cho thấy các nhà sản xuất đã thay đổi cách phối trộn, liều lượng và đặt tên khác cho sản phẩm, cùng 1 sản phẩm nhưng có nhiều tên khác nhau như cùng sản phẩm với đơn chất là Colistin nhưng có đến 7 tên khác nhau: Coli 1000, HHN-Coli, Colimeiji, Vicoli, ST Colizon, ADP Colizon, Coli-tialincomplex. Ngoài ra, nhiều loại kháng sinh điều trị cho người và gia súc cũng được người dân sử dụng trong thủy sản. Liều lượng sử dụng rất khó xác định vì là thuốc phối chế. 2.5 Kháng sinh 2.5.1 Khái niệm Hiện tượng kháng sinh được Alexander Fleming phát hiện từ năm 1928 thông qua việc phát hiện ra chất penicillin do một loại nấm có tên là Penicillin notatum sản sinh ra. Đến năm 1940 người ta đã sản xuất thành công penicillin thô thử nghiệm trên động vật có kết quả tốt, đến năm 1946 con người đã sản xuất ra được penicillin kết tinh, từ đó bắt đầu một thời kỳ mới, thời đại hoàng kim của y học: thời đại của chất kháng sinh. Theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006), kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học (do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sinh ra), hay do con người tổng hợp nên, có tác dụng một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu trong chu trình biến dưỡng của các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của nấm (tác nhân kháng nấm), của virus (tác nhân kháng virus). 2.5.2 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh Theo Bùi Quang Tề (2004) các thuốc kháng sinh có tác dụng độc lập với cấu trúc hóa học chính là do nó được gắn vào các điểm tác dụng, mà các điểm tác dụng này có thể xác định được một cách chắc chắn bằng các phương pháp hóa, lý k