Luận văn Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cây An điền hai hoa Hedyotis Biflora (L.) lam họ cà phê (Rubiaceae)

Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 2.1. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Thu hái và xử lý mẫu Mẫu cây tươi được thu hái ở vùng núi thuộc Huyện Khánh Vĩnh, Tỉnh Khánh Hòa vào tháng 6 năm 2006. Cây đã được nhận danh tên khoa học là cây An điền hai hoa (Hedyotis biflora (L.) Lam) bởi Dược sĩ Phan Đức Bình, Phó tổng biên tập Bán nguyệt san Thuốc và Sức khỏe thành phố Hồ Chí Minh. Một mẫu cây được ép khô và lưu giữ trong quyển lưu trữ tiêu bản thực vật, ký hiệu số US B-020 tại Bộ môn Hóa Hữu Cơ, Khoa Hóa – Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. Sau khi thu hái, mẫu cây tươi được cắt để lấy phần trên mặt đất (8,8 kg). Tiến hành rửa sạch, sấy khô, xay nhuyễn, thu được bột cây khô (1,2 kg). 2.1.2. Xác định độ ẩm Cân phần trên mặt đất (ở dạng tươi) cây An điền hai hoa, sấy ở nhiệt độ 1200C đến khi trọng lượng không đổi, cân lại trọng lượng mẫu khô. Thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình. Độ ẩm được tính theo công thức: Độ ẩm = x 100 (Trọng lượng tươi  trọng lượng khô) Trọng lượng tươi Kết quả xác định độ ẩm của bộ phận trên mặt đất của cây An điền hai hoa là 86,3%. 2.2. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Bột cây khô (1,2 kg) được trích kiệt bằng etanol theo phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, lọc, cô quay thu hồi dung môi, thu được cao etanol (112 gam). Dùng phương pháp trích pha rắn silica gel đối với cao etanol, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực: eter dầu hỏa, benzen, cloroform, acetat etyl và metanol. Dung dịch thu được từ cột đem cô quay, thu hồi dung môi ở áp suất kém thu được các cao: cao eter dầu hỏa, cao benzen, cao Trần Văn Thắng Trang 20 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả cloroform, cao acetat etyl và cao metanol. Qui trình điều chế và thu suất các loại cao được trình bày trong Sơ đồ 2.1 và Bảng 2.1 Các loại cao thu được từ Sơ đồ 2.1 được sắc ký lớp mỏng, giải ly bằng các hệ dung môi khác nhau như cloroform, cloroform:aceton (9:1), cloroform:metanol (9:1), hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%. Kết quả sắc ký lớp mỏng được trình bày trong các Hình 2.1. Nhận xét: Kết quả sắc ký lớp mỏng các loại cao cho thấy cao eter dầu hỏa B, cao cloroform, cao acetat etyl B cho các vết chính rõ, đẹp, do đó, chúng tôi chọn các loại cao này để khảo sát trước, các loại cao khác sẽ khảo sát sau. Bảng 2.1: Khối lượng và thu xuất các loại thu được cao so với bột cây khô Loại cao Ký hiệu cao Trọng lượng (g) Thu suất (%) Eter dầu hỏa A Eter dầu hỏa B Benzen A Benzen B Cloroform Acetat etyl A Acetat etyl B Metanol EA EB BA BB C AEA AEB MA 10,83 3,62 6,22 2,83 17,49 4,70 2,35 42,17 9,67 3,23 5,55 2,53 15,62 4,19 2,10 37,65 Tổng cộng 90,21 (g) 80,54 (%) Trần Văn Thắng Trang 21 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao - Trích kiệt với etanol bằng phương pháp ngâm dầm - Lọc, cô quay thu hồi dung môi Bột cây khô (1,2 kg) - Trích pha rắn silica gel - Giải ly với eter dầu hỏa - Cô quay thu hồi dung môi Cao etanol (112gam) - Giải ly với benzen - Cô quay thu hồi dung môi Cao eter dầu hỏa A (8,82 gam) Cao eter dầu hỏa B (3,62 gam) Cột còn lại - Giải ly với cloroform - Cô quay thu hồi dung môi Cột còn lại Cao benzen A (6,22 gam) Cao benzen B (2,83 gam) - Giải ly với acetat etyl - Cô quay thu hồi dung môi - Giải ly với metanol - Cô quay thu hồi dung môi Cao cloroform (17,49 gam) Cột còn lại Cao acetat etyl A (4,70 gam) Cao acetat etyl B (2,35 gam) Cột còn lại Cao metanol (42,17 gam) Cột bỏ Trần Văn Thắng Trang 22 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả A1 EA EB BA BB C A1 AEA AEB M A1 EA EB BA BB C (a) (b) (c) Hình 2.1: Sắc ký lớp mỏng các loại cao điều chế được theo Sơ đồ 2.1 Al : Cao etanol C : Cao cloroform EA : Cao eter dầu hỏa A AEA : Cao acetat etyl A EB : Cao eter dầu hỏa B AEB : Cao acetat etyl B BA : Cao benzen A M : Cao metanol A BB : Cao benzen B MB : Cao metanol B Dung môi giải ly: (a) cloroform (b) cloroform: aceton (9:1) (c) cloroform: metanol (9:1) Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Trần Văn Thắng Trang 23 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 2.3. TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY AN ĐIỀN HAI HOA 2.3.1. Kết tinh phân đoạn tinh thể khi điều chế cao eter dầu hỏa A của Sơ đồ 2.1 Khi trích pha rắn silica gel, giải ly với eter dầu hỏa, thu được dung dịch eter dầu hỏa. Khi cô quay đuổi dung môi thì thấy xuất hiện tinh thể hình kim, màu trắng. Tinh thể tan tốt trong dung môi eter dầu hỏa, sắc ký lớp mỏng trên tinh thể này thấy còn lẫn một ít tạp chất nên được tinh chế bằng sắc ký cột, thu được hợp chất, ký hiệu là BIFL-ETER11. Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-ETER11 được trình bày trong Hình 2.2 2.3.2. Sắc ký cột trên cao eter dầu hỏa B của Sơ đồ 2.1 Cao eter dầu hỏa B (3,62 g) có màu xanh đen. Kết quả sắc ký lớp mỏng cho một vết chính và nhiều vết mờ, vì vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel. Cao eter dầu hỏa B được nạp vào đầu cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ eter dầu hỏa đến cloroform. Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc ký lớp mỏng. Các lọ có sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.2. 2.3.2.1. Khảo sát phân đoạn 2 của Bảng 2.2 Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy phân đoạn 2 của Bảng 2.2 có một vết chính, do đó, chúng tôi tiếp tục thực hiện sắc ký cột silica gel trên phân đoạn này. Phân đoạn 2 (762 mg) được nạp vào đầu cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ eter dầu hỏa đến cloroform. Kết quả thu được 4 phân đoạn, trong đó phân đoạn 2 (lọ 15-18) có khối lượng 110 mg tiếp tục được sắc ký cột, sắc ký điều chế nhiều lần, thu được 4 mg một chất màu vàng, tan trong cloroform, ký hiệu là BIFL-ETER2. Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-ETER2 được trình bày trong Hình 2.4. Trần Văn Thắng Trang 24 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 2.3.2.2. Khảo sát phân đoạn 3 của Bảng 2.2 Khi cô quay thu hồi dung môi của các lọ thuộc phân đoạn 3 của Bảng 2.2, thu được một kết tủa màu trắng. Tiến hành gạn lọc nhiều lần, sau đó sắc ký cột, kết tinh lại trong dung môi cloroform, kết quả thu được một chất có tinh thể hình kim, màu trắng, ký hiệu là BIFL-ETER3. Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL- ETER3 được trình bày trong Hình 2.3. Bảng 2.2: Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao eter dầu hỏa B của Sơ đồ 2.1 Phân đoạn Số thứ tự lọ Dung môi giải ly Trọng lượng cao (mg) Nhận xét (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-109 E E:C (1:1) 800 Vết dài. Không khảo sát 2 110-189 E:C (1:1) 762 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-ETER2 3 190-289 E:C (1:1), C (100%) 420 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-ETER3 4 290-310 C:M (95:5), (9:1), (8:2), (1:1), M 1030 Vết dài. Không khảo sát . Tổng lượng cao thu được: 3,012 g Thu suất: 83,20% Ghi chú: E: eter dầu hỏa C M: metanol : cloroform Trần Văn Thắng Trang 25 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả EB E3 EA E11 Hình 2.3: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất Hình 2.2: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-ETER3 BIFL-ETER11 Dung môi giải ly: cloroform Dung môi giải ly: cloroform:aceton (9:1) EB: Cao eter dầu hỏa B EA: Cao eter dầu hỏa A E3 : BIFL-ETER3 E11 : BIFL-ETER11 (a) (b) EB E2 EB E2 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Hình 2.4: Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-ETER2 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. EB : Cao eter dầu hỏa B E2 : BIFL-ETER2 Dung môi giải ly: cloroform:aceton (9:1) (a) Không phun xịt dung dịch H2SO4 50%. (b) Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Trần Văn Thắng Trang 26 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 2.3.3. Sắc ký cột trên cao cloroform của Sơ đồ 2.1 Cao cloroform (17,49 g) có màu xanh đen. Kết quả sắc ký lớp mỏng cho 1 vết chính và nhiều vết mờ, vì vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel. Cao cloroform được nạp vào đầu cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ eter dầu hỏa đến metanol. Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc ký lớp mỏng. Các lọ có sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.3. 2.3.3.1. Khảo sát phân đoạn 1 của Bảng 2.3 Phân đoạn 1 của Bảng 2.3 (5,083g) có một vết chính màu hồng cánh sen và nhiều vết mờ khi chấm sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng. Do vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel trên phân đoạn này, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ cloroform đến metanol. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.4. Phân đoạn 2 của Bảng 2.4 có sắc ký lớp mỏng cho một vết màu hồng cánh sen. Khi cô quay thu hồi dung môi các lọ thuộc phân đoạn này, thu được một chất kết tủa màu trắng, tan tốt trong dung môi cloroform. Tiến hành gạn lọc nhiều lần, sau đó sắc ký cột, kết tinh lại trong dung môi cloroform, kết quả thu được một chất có tinh thể màu trắng, ký hiệu là BIFL-CLORO2. Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO2 được trình bày trong Hình 2.5 Phân đoạn 3 của Bảng 2.4 (180 mg) có sắc ký lớp mỏng cho hai vết trong đó có một vết màu vàng và một vết màu tím. Tiến hành sắc ký cột nhiều lần rồi sắc ký điều chế, kết tinh lại trong cloroform, thu được một chất có tinh thể màu trắng, ký hiệu là BIFL-CLORO1 (10 mg). Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong Hình 2.6. Phân đoạn 4 của Bảng 2.4 (759 mg) có sắc ký lớp mỏng cho một vết có màu vàng cam. Tiến hành sắc ký cột nhiều lần rồi sắc ký điều chế, kết tinh lại trong hệ dung môi cloroform:metanol (9:1), thu được một chất có tinh thể hình kim ngắn, Trần Văn Thắng Trang 27 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả màu trắng, ký hiệu là BIFL-CLORO4 (10 mg). Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong Hình 2.7. 2.3.3.2. Khảo sát phân đoạn 3 của Bảng 2.3 Phân đoạn 3 (1,201 gam) của Bảng 2.3 có sắc ký lớp mỏng cho một vết màu tím chấm sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng. Do vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel trên phân đoạn này, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ cloroform đến metanol. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.5. Khi cô quay thu hồi dung môi của các lọ thuộc phân đoạn 4 của Bảng 2.5, thu được một kết tủa màu trắng, tan tốt trong dung môi metanol và kém tan trong cloroform. Tiến hành gạn lọc nhiều lần, sau đó sắc ký cột, kết tinh lại trong dung môi metanol, kết quả thu được một chất có tinh thể màu trắng, ký hiệu là BIFL- CLORO3. Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO3 được trình bày trong Hình 2.8. Bảng 2.3: Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao cloroform của Sơ đồ 2.1 Phân đoạn Số thứ tự lọ Dung môi giải ly Trọng lượng cao (g) Nhận xét (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-39 E, E:A (8:2) 5,083 Lựa chọn để khảo sát tiếp. 2 40-250 E:A (8:2) 10,410 Vết dài. Không khảo sát 3 251-369 E:A (8:2), E:A (1:1) 1,201 Lựa chọn để khảo sát tiếp. 4 370-460 E:A (1:1) 0,898 Vết dài. Không khảo sát 5 461-500 E:A (1:1), A, M 0,872 Vết dài. Không khảo sát Thu suất: Tổng lượng cao thu được: 15,464 g. 88,42% RGhi chú: E: eter dầu hỏa A M: metanol : aceton Trần Văn Thắng Trang 28 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.4: Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn 1 của Bảng 2.3 Phân Số thứ Dung môi Trọng lượng Nhận xét đoạn tự lọ giải ly cao (mg) (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-9 C 252 Vết dài. Không khảo sát Có 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-CLORO2 2 10-26 C 3118 Có 2 vết chính. Sắc ký điều chế thu được hợp chất 3 27-72 C 180 BIFL-CLORO1 Có 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-CLORO4 4 73-200 C 759 201- 340 C, C:M (9:1), (8:2), (1:1), M 218 Vết dài. Không khảo sát 5 Tổng lượng cao thu được: 4,527 g. Thu suất: 89,06% Bảng 2.5: Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn 4 của Bảng 2.3 Phân Số thứ Dung môi Trọng lượng Nhận xét đoạn tự lọ giải ly cao (mg) (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-6 C, C:M (98:2) 59 Vết dài. Không khảo sát 2 7-83 C:M (98:2) 240 Vết dài. Không khảo sát C:M (98:2), (95:5) 3 84-93 68 Vết dài. Không khảo sát Có 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-CLORO3 4 94-101 C:M (95:5), (9:1) 432 5 102-217 C:M (9:1), (8:2), (1:1), M 218 Vết dài. Không khảo sát Tổng lượng cao thu được: 1,017 g. Thu suất: 84,68% C M: metanol: cloroformGhi chú: Trần Văn Thắng Trang 29 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả C C2 C C1 Hình 2.5: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất Hình 2.6: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO1 Dung môi giải ly: cloroform:metanol (9:1) C : Cao cloroform C1: BIFL-CLORO1 BIFL-CLORO2 Dung môi giải ly: cloroform:aceton (9:1) C: Cao cloroform C2: BIFL-CLORO2 C C3 Hình 2.8: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO3 Dung môi giải ly: cloroform:metanol (9:1) C : Cao cloroform C3: BIFL-CLORO3 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Hình 2.7: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO4 Dung môi giải ly: cloroform:metanol (9:1) C : Cao cloroform C4: BIFL-CLORO4 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. C C4 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Trần Văn Thắng Trang 30 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.6: Kết quả sắc ký cột silica gel cao acetat etyl B của Bảng 2.1. Phân Số thứ Dung môi Trọng lượng Nhận xét đoạn tự lọ giải ly cao (mg) (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-32 C, C:M (95:5), (9:1) 285 Vết dài. Không khảo sát. 2 33-40 C:M (9:1) 121 Vết dài. Không khảo sát. 3 41-51 C:M (9:1) 98 2 vết chính. Khảo sát 4 52-137 C:M (9:1), (8:2) 568 Vết dài. Không khảo sát. 5 138-224 C:M (8:2), (1:1), M 1125 Vết dài. Không khảo sát. Tổng lượng cao thu được: 2,197 g Thu suất: 93,49% Ghi chú: M: metanol C: cloroform Bảng 2.7: Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn 3 của Bảng 2.6 Phân Số thứ Dung môi Trọng lượng Nhận xét đoạn tự lọ giải ly cao (mg) (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-10 C, C:M (95:5) 2 Vết dài. Không khảo sát. 2 11-25 C:M (95:5) 6 Vết dài. Không khảo sát. 3 26-40 C:M (95:5) 8 Vết dài. Không khảo sát. Sắc ký điều chế thu được BIFL-AE2 và BIFL-AE3. 4 41-60 C:M (95:5) 80 Tổng lượng cao thu được: 96 mg. Thu suất: 97,96% Ghi chú: C M: metanol : cloroform Trần Văn Thắng Trang 31 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 2.3.4. Sắc ký cột trên cao acetat etyl B của Sơ đồ 2.1 Cao acetat etyl B (2,35 g) có màu vàng cam. Kết quả sắc ký lớp mỏng cho một vết chính, vì vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel. Cao acetat etyl C được nạp vào đầu cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ cloroform đến metanol. Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc ký lớp mỏng. Các lọ có sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.6. Phân đoạn 3 của Bảng 2.6 (98 mg) có sắc ký lớp mỏng cho hai vết, trong đó có một vết màu tím và một vết màu đen khi chấm sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng. Do vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel trên phân đoạn này, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ cloroform đến metanol. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.7. Phân đoạn 4 của Bảng 2.7 (80 mg) có sắc ký lớp mỏng cho hai vết, trong đó có một vết màu tím và một vết màu đen khi chấm sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng. Do vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký điều chế và sắc ký cột nhiều lần trên phân đoạn này, thu được hai hợp chất, ký hiệu là BIFL- AE2 và BIFL-AE3. 2.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHÂT CÔ LẬP ĐƯỢC 2.4.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-ETER11 Hợp chất BIFL-ETER11 thu được từ cao eter A, có đặc điểm như sau: Tinh thể hình kim màu trắng. ¾ 0¾ Điểm nóng chảy: 145-148 C (Kết tinh trong cloroform). ¾ Sắc ký lớp mỏng, giải ly bằng hệ dung môi cloroform, hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 50%, sấy bản ở 1100C cho một vết màu nâu đỏ, sau chuyển xanh đen, có giá trị Rf = 0,33 (Hình 2.2) 1 HPhổ H – NMR, (CDCl3), (Phụ lục 1), δ ppm: 5,35 (3H, t, J=3 & 2Hz, =C -, H-6, H-6’); 5,15 (1H, dd, J =8,5 & 15Hz, =CH-, H-22); 5,01 ( 1H, dd, J=8,5 & 15Hz, =CH-, H-21); 3,55 (3H, m, -CH-OH, H-3, H-3’). Trần Văn Thắng Trang 32 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Biện luận cấu trúc Kết quả sắc ký lớp mỏng hợp chất BIFL-ETER11 cho một vết màu nâu đỏ khi hiện hình bởi dung dịch acid H2SO4 50% (Hình 2.2) nên đây có thể là một sterol hoặc triterpen. 1 Phổ H–NMR có ba proton tại δ ppm 5,35 (=CH-) và hai proton tại δ ppm 5,15 (dd, =CH-); 5,01 (dd, =CH-) ngoài ra còn một nhóm >CH-OH. Đây là những mũi proton đặc trưng của các hợp chất stigmasterol và β-sitosterol. Như vậy, hợp chất BIFL-ETER11 là hỗn hợp của stigmasterol và β-sitosterol. Nếu gọi x là số proton hydrogen của stigmasterol và x’ là số proton hydrogen của β-sitosterol thì khảo sát một số diện tích tích phân một số tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1H – NMR của hợp chất BIFL-ETER11, nhận thấy như sau: H6 + H6’ = 3 H22 + H23 = 2 H3 + H3’ = 3 Kết quả tính toán cho thấy hợp chất BIFL-ETER11 là hỗn hợp hai hợp chất stigmasterol và β-sitosterol với tỉ lệ 2:1. Stigmasterol β–Sitosterol (BIFL-ETER11) 2.4.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-ETER2 Hợp chất BIFL-ETER2 thu được từ cao eter dầu hỏa B có đặc điểm sau: ¾ Là chất rắn, màu vàng, tinh thể hình kim (Kết tinh trong cloroform). ¾ Sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung môi cloroform:aceton (9:1), hiện hình một vết màu vàng, hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 50%, sấy bản ở 1100C cho một vết màu hồng nhạt, sau đó hóa đỏ cam, có giá trị Rf = 0,33 (Hình 2.3). Trần Văn Thắng Trang 33 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả ¾ Phổ MS-ESI (Phụ lục 2) cho mũi ion phân tử với m/z=314,9 [M+H]+ (ghi nhận ion dương) và m/z=313,0 [M-H]─ (ghi nhận ion âm), phù hợp với công thức phân tử C17H14O6 (M=314). 1¾ Phổ H–NMR, (CDCl3), (Phụ lục 3), δ ppm: 8,1 (1H, d, J=8,5Hz, =CH-, H-8); 8,0 (1H, d, J=8,5Hz, =CH-, H-4); 7,3 (1H, d, J=8,5Hz, =CH-, H-3); 7,2 (1H, d, J=8,5Hz, =CH-, H-7); 6,5 (1H, s,-O-H); 4,0 (3H, s, -OCH3, H-15); 3,99 (3H, s, -OCH3, H-16); 3,98 (3H, s, -OCH3, H-17). 13C–NMR, (CDCl¾ Phổ 3), (Phụ lục 4), kết hợp với DEPT – NMR 90 và 135 (Phụ lục 5) cho thấy hợp chất BIFL-ETER2 có 17 carbon. Độ dịch chuyển hóa học của các carbon được trình bày trong Bảng 2.8. ¾ Phổ HSQC (Phụ lục 6) và HMBC (Phụ lục 7). Biện luận cấu trúc 1Phổ H–NMR cho thấy có 8 tín hiệu cộng hưởng, trong đó có một mũi đơn tại δ ppm 6,59, theo phổ HSQC thì proton này không tương quan với carbon nào, nên đây là proton của nhóm -OH; bốn mũi đôi, mỗi mũi một proton, tại δ ppm 8,10; 8,07; 7,32; 7,25 đều có cùng J=8,5Hz, theo phổ HSQC thì bốn proton này là của bốn =CH- vòng thơm có mũi cộng hưởng 13C tại δ ppm 116,01; 120,09; 125,01và 125,54, vì vậy có 2 cặp proton vòng thơm ở vị trí orto với nhau. Ngoài ra, phổ 1H–NMR còn có ba mũi đơn, mỗi mũi ba proton tại δ ppm 4,01; 3,99 và 3,98, theo phổ HSQC thì các proton này là của ba nhóm –OCH 133 có mũi cộng hưởng C tại δ ppm 56,32; 61,34 và 62,28. Phổ 13C kết hợp DEPT–NMR cho thấy có 17 carbon, trong đó có hai mũi của carbon tứ cấp tại δ ppm 181,94; 181,75, đây là hai mũi đặc trưng của hai carbon carbonyl trong khung antraquinon. Theo phổ HMBC, proton của nhóm hydoxyl có tương quan với carbon tại δ ppm 120,09; 154,87. Theo phổ HSQC, carbon tam cấp tại δ ppm 120,09 tương q